靚麗乳菇菌絲高效擴增培養的方法*

孫舉志，陳菲菲，李紅英，向 全，楊永康**

（1.恩施土家族苗族自治州農業科學院，湖北 恩施 445000；2.恩施市屯堡鄉農業服務中心，湖北 恩施 445026）

乳菇（Lactariusspp.）與松茸（Tricholoma matsutake）、塊菌（Tuber melanosporum）、美味牛肝菌（Boletus edulis）等都屬于珍稀名貴食用菌，其營養價值高，味道鮮美，頗受人們喜食。乳菇屬（Lactarius）真菌為一類外生菌根真菌，依靠與松科（Pinaceae）、殼斗科（Fagaceae）和樺木科（Betulaceae）等植物的根系形成的外生菌根共生體系生長，脫離宿主植物后無法形成子實體[1]。乳菇菌絲與植物根尖接觸后能夠侵染進入到根的皮層細胞間隙并形成哈蒂氏網[2-3]，即可從植物體內獲取營養；且松乳菇（Lactarius deliciosus）等菌根菌的孢子萌發需要植物根系分泌物的刺激誘導[4]。由于乳菇特殊的營養條件及生態條件要求，難以實現大規模人工栽培，目前農貿市場銷售的乳菇主要靠野外采集。但常年采集野外乳菇破壞了其菌根生長環境，導致了“產量逐年降低，市場供不應求，產品價格一直居高不下”的惡性循環[5]。

外生菌根類食用菌不同于一般腐生型食用菌，其菌種的分離以及培養都較困難。主要表現為菌絲生長緩慢，菌種的分離培養過程容易被污染，為后期菌種的擴繁以及人工馴化栽培帶來了較大挑戰。目前，乳菇的栽培已經能夠以半人工栽培技術達成，即通過人工合成菌根化苗后移栽至栽培園[6]；其關鍵技術為利用乳菇菌絲侵染馬尾松（Pinus massoniana）的幼嫩根尖建立菌根合成苗共生體[7]。但是，由于菌根的生長發育對宿主植物和土壤微環境均存在一定偏好，往往合成效率不高，且菌根苗移栽至栽培園后至少需要3年~5年才可生長出子實體；生長周期較長、產量較低、土地使用成本高以及栽培和管理面臨的技術性問題較多，是菌根苗栽培技術不適合大面積推廣應用的根本原因[8]。因此，實現對乳菇的人工馴化栽培一直是菌根真菌研究領域亟待解決的科學問題。此次通過以組織分離得到的靚麗乳菇（Lactarius vividus）為研究對象，開展乳菇菌絲高效擴增培養方法的研究，以期為將來實現乳菇的人工馴化栽培奠定基礎，為開展其他類外生菌根真菌的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

乳菇屬樣品采集自恩施市三岔鎮天池山，單株分開，用雙層紗布包好后放入低溫冷藏箱運送至實驗室。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養基，購自上海瑞楚生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離

選擇顏色鮮艷、無病蟲害、菇形圓整、菌蓋肥厚且未完全開傘、菌柄完好無損的單生子實體，用作組織分離材料。

先用吹風機吹掉菌蓋和菌柄表面雜質，或用衛生紙輕輕擦拭菇體表面；用無菌剪刀剪掉帶泥的菌柄基部；徒手沿著子實體將其縱向撕成兩半；用解剖刀從內部切取3 mm~5 mm的組織塊，放入PDA平板培養基。將平板置于生化培養箱，設置溫度為21℃，濕度為60%，進行避光培養。由于不同菌株的萌發能力存在一定差異，且試驗過程難免出現污染，因此，每次至少選用5個子實體進行分離試驗。

1.2.2 菌株的分子鑒定

將培養得到的菌株（編號esr-1）送至廣東美格基因科技有限公司測序。基于ITS序列進行分析，使用Mothur軟件進行序列拼接，與NCBI的NT庫進行BLAST比對和自動排序，排好的序列用MEGA 7.0中的Neighbor-Joining建系統發育樹，外類群為Lactarius salmonicolour。

1.2.3 擴增培養方法

1）傳統培養法

在PDA固體培養基表面放上直徑為9 cm的無菌玻璃紙；截取菌落邊緣的尖端菌絲塊，約0.5 mg，大小為0.3 cm2~0.5 cm2，放于平板培養基的玻璃紙上；于生化培養箱避光培養，設置溫度為21℃，濕度為60%。每個處理5個重復。

2）組織破碎再培養法

取約0.5 mg新鮮菌塊于1.5 mL離心管中，加入800μL無菌水和4顆小鋼珠（直徑為2 mm）；將離心管放入高通量組織研磨器（SCIENTZ-48），65 Hz條件下破碎1.5 min，所得混合液用于涂布。在PDA固體培養基表面放上直徑為9 cm的無菌玻璃紙；取150μL菌絲混合液于平板中央，用玻璃鏟均勻涂布；于生化培養箱避光培養，溫度為21℃，濕度為60%。每個處理5個重復。

1.2.4 計算菌絲生長速度

采用“十”字交叉法測量菌絲生長速度。待菌絲停止生長后，從平板底部劃“十”字形，垂直交叉測量菌落直徑，計算平均值，以平均直徑（cm）除以生長時間（d）即得菌絲生長速度（cm·d-1）。

1.2.5 計算菌絲干質量

通過稱量菌絲干質量反映其總生物量。菌絲停止生長時，將菌絲從玻璃紙上取下，于烘箱中50℃烘干24 h，進行稱重。

1.2.6 觀察和記錄

每隔7天觀察菌絲生長狀況，包括菌絲濃密程度、是否有瘤狀物和分泌物、雜菌污染情況，記錄生長時間。

1.2.7 數據分析

菌絲生長速度和菌絲干質量用SigmaPlot進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

取不同的分離部位對乳菇菌絲生長以及分離的成功率大小有較大影響，此次根據鄭旋等[9]研究結果，于菌柄和菌蓋交界處取內部組織進行培養。子實體形態及分離純化后的菌絲形態見圖1。

圖1 乳菇屬樣品的子實體形態和菌絲形態Fig.1 Morphology of fruit body and mycelia of Lactarius sp.samples

如圖1A所示，采集到的子實體顏色為橙色，新鮮無病害；菌蓋未完全展開，扁半球形；菌褶較密，與菌蓋同色；菌柄健壯，近圓柱形，內部中空。如圖1B所示，取菌柄和菌蓋交界處的內部組織于PDA培養基培養，萌發形成的菌絲顏色為棕黃色，菌絲粗壯；基質菌絲發達，氣生菌絲較弱；菌絲表面有乳黃色液體分泌物，無瘤狀物，菌絲濃密，呈放射平鋪生長。

將分離獲得的菌株esr-1進行ITS測序分析，采用MEGA 7.0軟件鄰位連接法，進行1 000次的相似度重復計算，外類群為Lactarius salmonicolour。菌株esr-1與相關物種的ITS rDNA序列系統發育樹見圖2。

圖2 基于ITS構建的菌株esr-1系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain esr-1 based on ITS

如圖2所示，在系統發育樹上菌株esr-1以較高的自舉支持率與靚麗乳菇Lactarius vividus聚為一支，因此鑒定為靚麗乳菇，又名鮮艷乳菇[10]。將菌的ITS序列提交GenBank數據庫，獲得相應的登錄號為ON318973。

2.2 不同培養方法下菌絲的生長情況

2.2.1 不同培養方式下的菌落形態

采用傳統的尖端菌絲純培養法和菌絲組織破碎再培養法進行菌絲的擴增培養，靚麗乳菇的菌落特征見圖3。

圖3 不同培養方法下靚麗乳菇菌株esr-1的菌落特征Fig.3 Colony characteristics of Lactarius vividus strain esr-1 under different culture methods

如圖3所示，以傳統培養法進行培養后，靚麗乳菇的基質菌絲發達，氣生菌絲很弱；利用組織破碎儀將菌絲打斷后再涂布培養，其基質菌絲和氣生菌絲都很發達，菌絲聚集生長，向上隆起形成單個菌落。

2.2.2 不同培養方式下的菌絲生長速度

采用傳統培養法和組織破碎再培養法進行菌絲培養，靚麗乳菇菌株esr-1的菌落直徑、生長時間詳見表1，菌絲平均生長速度見圖4。

表1 不同培養方法下靚麗乳菇菌株esr-1菌絲的生長情況Tab.1 The mycelial growth of Lactarius vividus strain esr-1 under different culture methods

如表1和圖4所示，傳統培養法下，菌絲停止生長時菌落直徑為（6.600±0.190）cm，生長時間為（63.000±1.225）d，菌絲平均生長速度為（0.100 0±0.002 4）cm·d-1。組織破碎再培養法，菌落直徑為（7.550±0.146）cm，生長時間為（29.000±1.414）d，菌絲平均生長速度為（0.260 0±0.011 7）cm·d-1。將菌絲用組織破碎法打斷后再涂布培養，菌絲的生長速度提高160%，培養時間縮短54%，差異達到極顯著水平（P＜0.001）。

圖4 不同培養方法下靚麗乳菇菌株esr-1菌絲的平均生長速度Fig.4 The average mycelial growth rate of Lactarius vividus strain esr-1 under different culture methods

2.2.3 不同培養方法下的菌絲干質量

采用傳統培養法和組織破碎再培養法進行菌絲培養，菌絲長滿平板時靚麗乳菇菌絲的干質量見圖5。

圖5 不同培養方法下靚麗乳菇菌絲的干質量Fig.5 Dry weight of Lactarius vividus mycelia under different culture methods

如圖5所示，傳統培養法下，菌絲停止生長時靚麗乳菇菌絲的干質量為（0.050 0±0.014 3）g；組織破碎再培養法下，菌絲的干質量為（0.270 0±0.030 5）g，增加440%；兩者差異達到極顯著水平（P＜0.001），菌絲的生物總量得到極顯著增加。由此可見，菌絲的組織破碎法可作為快捷、高效的培養方法。

3 討論與結論

3.1 組織分離法

在對樣品進行組織分離前最好不要用酒精棉球擦拭表面進行消毒，只需要用棉刷清除表面雜質即可。很多報道中用酒精消毒的方法并不值得推薦，因為菌蓋表面的雜菌可能會隨著酒精滲透進入組織內部，造成污染。更不可使用升汞或次氯酸等其他消毒液，因為這些消毒液會直接影響組織塊的萌發。

在分離過程中切忌使用刀片將菌蓋切開，因為菌蓋表面的雜菌會隨著刀刃走過的位置進入組織內部，從而造成污染；直接徒手將子實體掰開，再用無菌刀片挑取內部菌肉組織更能保證分離的成功率。且分離前注意去掉菌柄基部，因為基部土壤雜菌較多。

3.2 乳菇菌絲的高效擴增培養

鄭璇等[9]使用PDA培養基培養松乳菇菌絲，第30天時菌落直徑只有0.65 cm，之后菌絲停止生長；雖然使用酵母葡萄糖培養基可以提高其菌絲生長速度，但菌落直徑最大也只能達到3.2 cm。菌絲經過破碎后再培養，干質量可達0.27 g。而王冉等[7]使用PDA培養基培養的靚麗乳菇，菌絲干質量最大也只有0.13 g，菌落直徑為4.03 cm。陳新等[8]綜合報道表示，大多乳菇類真菌菌絲的生長速度較為緩慢，需要約45 d～75 d才能長滿平板。此次研究結果顯示，菌絲用組織破碎儀打斷成小片段后再培養，相比傳統的培養方法，生長速度提高160%，干質量增加440%，時間縮短54%，菌絲的生長速度和生物量都得到極顯著提高。

采用組織破碎儀打斷菌絲后再培養，其基本原理為一條菌絲經過打斷后變成若干條小片段菌絲，這些菌絲片段又開始以頂端生長方式向前延伸生長，因此極大地提高了接種量，菌絲能相對快速地鋪滿平板，明顯縮短生長周期。相比傳統的截取尖端菌絲的傳代培養方法，菌絲的組織破碎再培養法具有生長速度快、生物量大、培養周期短等優點，該方法適用于不同培養條件下的乳菇菌絲擴增培養，使用范圍廣且操作簡便。

此次僅對菌絲的擴增培養方式和方法進行了探討，后續還可以從培養基營養組分上進行研究，除了常用的PDA培養基外，也可以選擇BAF、MMN、Pach、MYA等培養基進行篩選[7]。

3.3 未來研究方向

外生菌根類真菌不僅依賴于宿主植物，且與根際土壤微生物也存在密切的聯系，菌根、宿主植物、土壤微生物環境三者構成了一個復雜的相互作用體系。菌根形成過程中植物根尖對菌絲體共生信號的識別以及與根際微生物互作機制的研究都值得深入探討。未來還可以從基因組水平和分類進化水平加強研究，分析菌根真菌與腐生菌的起源以及演化關系。通過基因組測序分析獲得可供研究的某些功能基因，例如在乳菇類等共生菌中纖維素酶和木質素酶等相關基因的完整性。克隆相關功能基因，建立成熟的轉基因遺傳體系，通過轉入缺失的關鍵基因可能有望實現菌根真菌脫離宿主植物形成子實體。