胎盤MSCs治療絕經后骨質疏松骨折Wnt/β-catenin、OPG/RANKL關鍵因子的變化*

麥彩園 王 斌

1 廣東省婦幼保健院產科，廣東省廣州市 510010； 2 佛山市三水區人民醫院創傷骨科

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)為一類多能干細胞，在成骨和代謝中有明顯的促進作用[1]。胎盤是一種容易獲得MSCs的來源，PMSCs已經證實與骨MSCs具有幾乎相同的功能[2]。LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL是Wnt/β-catenin、OPG/RANKL通路的關鍵因子。LRP5、β-catenin、Runx2是Wnt/β-catenin通路關鍵的成骨因子[3]。OPG、RANKL是OPG/RANKL通路關鍵的破骨因子[4]。本文取人胎盤，培養PBMC，傳代，注射于絕經后骨質疏松大鼠骨折端。RT-qPCR檢測LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL因子在大鼠骨髓腔的表達。

1 材料與方法

1.1 儀器與實試劑 培養基、膠原酶Ⅰ型、DNase Ⅰ、PercoⅡ液：Sigma公司，美國。FCS、TrypLE、胰酶：Bio-Rad公司，英國。qPCR試劑盒、引物：Takara公司，中國。流式細胞儀、培養箱、PCR檢測系統：Bio-Rad公司，美國。

1.2 研究對象 研究方案遵照赫爾辛斯基宣言有關規定，經佛山市三水區人民醫院的臨床試驗及動物倫理委員會審查通過，病人知情并同意。本研究選擇2021年1—12月在三水區人民醫院招募的足月生產婦女，取得胎盤10例。Sprague-Dawley(SD)大鼠購自廣州賽業生物有限公司。

1.3 PMSCs獲取 取足月生產胎盤，排出臍帶血，拋棄臍帶和外膜。將胎盤組織(包括羊膜、絨毛膜和胎盤)解剖成約5g大小的碎片(總共300g)。將該組織置于燒杯中并用500ml HBSS/100g組織洗滌。然后將胎盤片以約10g/管平均分配。將低糖培養基與100U/ml膠原酶Ⅰ型和5μg/ml DNase I添加到每個試管中，總體積為50ml。將試管在振蕩器上孵育(220r/min，37℃，2h)，然后以540g脈沖離心以去除大顆粒物質，并使細胞懸浮液通過70μm過濾器。剩余的組織用HBSS洗滌，得到的細胞懸液也通過70μm過濾器過濾。將合并的過濾細胞離心(540g，5min，20℃)并重新懸浮在30ml HBSS中，并在12ml 1.073g/ml PercollTM下鋪墊。將樣品離心(540g，20℃，20min)，取出界面并用HBSS洗滌2次(第一次在540g，20℃，10min，第二次在300g，20℃，5min)。然后將單核細胞以(2～4)×105個細胞/cm2接種在組織培養瓶中進行離體擴增。

1.4 細胞培養 將骨髓或胎盤細胞接種到25或75cm2組織培養瓶中。標準組織培養基含有20%(v/v)的FCS和50μg/ml慶大霉素的基礎培養基。非熱滅活FCS用于所有后續實驗。培養物在加濕的5%CO2培養箱中培養，培養基每周更換2次。在擴增培養物中通過塑料黏附分離細胞，3d后將非黏附細胞從培養物中洗掉。

細胞培養物在90%～95%濃度時進行傳代。燒瓶用HBSS洗滌并與TrypLETMSelect在37℃下孵育5～10min。去除解離的細胞，然后離心(540g，5min，4℃)沉淀。棄去上清液并將細胞重懸于組織培養基中。在第1代，每個實驗將MSCs接種到三個重復的燒瓶中。從第2代開始，將細胞從一個燒瓶中接種到另一個燒瓶中。

1.5 鑒定胎盤間充質干細胞 取第3代培養的干細胞，以0.25%濃度的胰酶消化3min后制成單細胞懸液，加入CD90、CD44、CD34、CD45抗體表達單克隆抗體，冰上反應20min，PBS洗2次后離心5min(4℃，1 000r/min)，棄上清，加入2ml PBS將其吹打混勻，以流式細胞儀檢測細胞表面標志物。

1.6 構建去卵巢骨質疏松模型

1.6.1 模型建立：從廣州賽業生物有限公司購買雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠[重(280±20)g]。將所有大鼠單獨飼養在透明塑料籠中，在受控的光照下(12h光照/黑暗周期)，溫度(25±2)℃和濕度(50±10)%。老鼠可以自由獲取食物和水。

1.6.2 分組標準：適應1周后，將大鼠隨機分為三組：對照組、骨質疏松組、干細胞組。骨質疏松組、干細胞組大鼠腹腔注射7%水合氯醛5ml/kg，麻醉成功后，先固定老鼠。然后以第12根肋骨的后部為中心將毛剃光。消毒后，切開3cm長的縱向切口，仔細剝離皮膚和筋膜，然后暴露卵巢。接下來，結扎卵巢下方的輸卵管，并切除兩個卵巢。最后，沖洗切口后，縫合并包裹皮膚。對照組不摘除卵巢，僅行假手術，切開皮膚再予以縫合。

1.6.3 模型處理：進行常規術后護理和飲食。術后8周，所有大鼠行擺鋸開放式小腿截骨制作骨折并取骨髓3ml，然后予以克氏針固定。用注射器吸取PMSCs并注射于絕經后骨質疏松大鼠骨折端及髓腔。骨髓行RT-qPCR檢測LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL的水平。

1.6.4 后續處理：繼續常規護理和飲食。1個月后處死全部大鼠并開放骨折部位觀察并取骨髓3ml，RT-qPCR檢測LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL的水平。

1.7 定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 用Trizol試劑分離來自大鼠股骨的總RNA。RNA的在260/280nm處進行吸收測量，證實達到PCR的要求。用cDNA合成試劑盒合成cDNA。使用ABI 7500序列檢測系統進行qRT-PCR。相對表達水平用2-ΔΔCt方法計算，GAPDH作內參對照。引物由Takara公司設計的，引物序列5’to 3’:LRP5-F：CCTGGCGCTGTGACGGCTTCC,LRP5-R：CAATGGC GCTGCTGTGGGCTGGTA;Runx2-F:GAACCCACGGCCCTCCCTGAACTC，Runx2-R:AGCGGCGTGGTGGAATGGATGGAT;β-catenin-F:TGGTGGGCTGCAGAAAATGGTT，β-catenin-R:ACGATGGCCGGCTTGTTGC;OPG-F：TCCTGGCACCTACCTAAAACAGCA,OPG-R:CTACACTTCTGCATTCACTTTGG;RANKL-F：CCATCGGGTTCCATAAAGTAGT,RANKL-R：AAAGCCCCAAAGTACGTCGCATCT;β-actin-F：CACCCGCGAGTACAACCTTC，β-actin-R：CCCATACCCACCATCACACC。所有測定均重復3次。

1.8 實驗內容及觀察指標 取人胎盤，培養PMSCs。流式細胞儀檢測第3代PMSCs。建立大鼠骨折模型，隨機分為三組：對照組(假手術未去卵巢)、骨質疏松組(去卵巢骨質疏松)、干細胞組(去卵巢骨質疏松+干細胞治療：用注射器吸取PMSCs并注射于絕經后骨質疏松大鼠骨折端及髓腔)。于大鼠小腿取骨髓，行克氏針內固定，檢測LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL因子在大鼠骨髓腔的表達。1個月后處死動物，骨折處骨髓再次檢測以上因子的表達。比較骨折時與1個月后各因子的變化，以及比較各組間的水平。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測 流式細胞儀顯示，第3代PMSCs高表達CD44、CD90，而CD34、CD45呈陰性表達。結果表明實驗培養的細胞具備干細胞的表面標志物，可證實為胎盤間充質干細胞。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測第3代PMSCs

2.2 因子LRP5、β-catenin、Runx2、OPG、RANKL在骨折端骨髓的變化

2.2.1 骨折時骨質疏松組與干細胞組相比LRP5、β-catenin、Runx2、OPG差異不大，但與對照組相比明顯降低(P<0.05)；骨質疏松組與干細胞組相比RANKL差異不大，但與對照組相比明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 骨折時各因子的表達

2.2.2 術后1個月與骨折時相比，對照組各指標變化不大，而骨質疏松組、干細胞組LRP5、β-catenin、Runx2、OPG明顯增加，RANKL明顯下降，差異明顯(P<0.05)。見圖3。術后1個月與對照組、骨質疏松組相比，干細胞組LRP5、β-catenin、Runx2、OPG明顯上升，且RANKL明顯下降，差異明顯(P<0.05)。見圖3。

圖3 術后1個月各因子的表達

3 討論

骨髓是人類MSCs的傳統來源，骨髓間充質干細胞具有增殖特性，它能促進缺損修復，而且可通過基因修飾的方式表達治療因子，遷移并發揮治療作用[5]。MSCs在細胞治療方面比許多其他細胞類型具有優勢，因為它們具有免疫特權，即使在大型動物中，通常也可以跨越主要組織相容性復合體(MHC)屏障進行移植，而無須免疫抑制[6]。人類MSCs是由多種組織和器官產生的，包括胎盤、臍帶血、羊膜、羊水、脂肪、肺和肝臟[7]。大多數骨髓等組織來源的Msc，比較難以獲取，相比之下，胎盤組織很容易獲得。胎盤來源間充質干細胞具有更強的成骨能力[8-9]。

體外誘導培養的PMSCs用軟骨誘導培養基培養后，可以分化為軟骨細胞，誘導軟骨細胞膝關節腔內注射后軟骨細胞均有修復，效果優于玻璃酸鈉腔內注射治療[10]。PMSCs可能通過調控炎癥因子水平，進而減輕類風濕關節炎大鼠的關節軟骨破壞[11]。

在Wnt/β-catenin通路中，LRP5存在于細胞膜表面，Wnt與LRP5/6結合形成復合體，抑制β-catenin的磷酸化。未磷酸化的β-catenin積累進入到細胞核和轉錄因子結合激活下游靶基因Runx2，LRP5、β-catenin、Runx2是互相促進的引起成骨的基因[12]。

OPG/RANKL通路包括:RANKL-核因子κβ活化受體配體、RANK-NF-κβ活化受體、OPG-RANKL的假性受體骨保護素。OPG與RANKL有著高親和力，能競爭RANKL和RANK間的互相作用，抑制破骨細胞[13]。RANKL是目前發現的體內僅有的促進OC分化、阻止OC凋亡的因子[14]。

骨折時骨質疏松組與干細胞組相比LRP5、β-catenin、Runx2、OPG差異不大，但與對照組相比明顯降低；骨質疏松組與干細胞組相比RANKL差異不大，但與對照組相比明顯升高。說明LRP5、β-catenin、Runx2、OPG為成骨因子，RANKL為破骨因子，與前結論一致。術后1個月與骨折時相比，對照組各指標變化不大，而骨質疏松組、干細胞組LRP5、β-catenin、Runx2、OPG明顯增加，RANKL明顯下降。說明在骨折生長過程中，成骨因子的增強，破骨因子的減弱。術后1個月與對照組、骨質疏松組相比，干細胞組LRP5、β-catenin、Runx2、OPG明顯上升，RANKL明顯下降。說明PMSCs明顯地促進了成骨，同時減少了破骨。

總之，Wnt/β-catenin、OPG/RANKL通路中成骨因子LRP5、β-catenin、Runx2、OPG在骨質疏松中下降，破骨因子RANKL在骨質疏松中上升。PMSCs可引起LRP5、β-catenin、Runx2、OPG在骨質疏松中上升，RANKL在骨質疏松中下降。PMSCs通過調控Wnt/β-catenin、OPG/RANKL通路的關鍵因子促進骨質疏松性骨折成骨，促進生長。我們可以進一步研究PMSCs預防骨質疏松和治療骨質疏松性骨折。