芫根對(duì)膿毒癥小鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制初探#

李仟 羅太富 馮梓琦 朱玲 萬(wàn)莉紅△ 江舟

（1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)2018 級(jí)，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)2020 級(jí)，四川 成都 610041；3. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)2019級(jí)，四川 成都 610041；4. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041；5. 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)時(shí)間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（四川大學(xué)），四川 成都 610041）

膿毒癥（Sepsis）是由細(xì)菌等病原微生物侵入機(jī)體引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，常以彌漫性腦功能障礙為首發(fā)表現(xiàn)[1]。患者臨床上主要表現(xiàn)為躁動(dòng)、注意力下降、意識(shí)改變、睡眠節(jié)律紊亂、譫妄等，且患者可能存在長(zhǎng)期的認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量和自理能力[2]。因此明確發(fā)病機(jī)制，尋找診斷、治療的新靶點(diǎn)刻不容緩。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是細(xì)胞和機(jī)體對(duì)缺氧穩(wěn)態(tài)反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)激活多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與包括能量代謝、血管生成、細(xì)胞凋亡等多種生命體活動(dòng)[3,4]。研究表明，HIF-1α 在膿毒癥引起的肺組織、心肌組織損傷中均明顯上調(diào)[5,6]，可見(jiàn)在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中HIF-1α 發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為在HIF-1α 的作用下，丙酮酸由進(jìn)入三羧酸循環(huán)，轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯由蔀槿樗幔瑢?dǎo)致大量乳酸堆積進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體系統(tǒng)等，最終引起組織的損傷和死亡[7]。活化的蛋白激酶C 受體1（Receptor for activated C kinase 1，RACK1）作為體內(nèi)廣泛表達(dá)的一種支架蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、自噬、免疫等多種重要作用[8]。目前研究表明，RACK1 作為HIF-1α 的負(fù)調(diào)控因子，可通過(guò)泛素化途徑降解HIF-1α[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生認(rèn)知功能障礙的膿毒癥小鼠同時(shí)出現(xiàn)腦葡萄糖代謝下降以及RACK1 表達(dá)降低，可見(jiàn)調(diào)控RACK1/HIF-1α 通路有可能成為耐缺氧藥物的潛在靶點(diǎn)。

芫根是西藏道地食、藥、飼三用植物，資源豐富。在藏醫(yī)典籍《甘露本草明鏡》、《四部醫(yī)典》、《新編藏醫(yī)學(xué)》等中均記載有，芫根具有耐缺氧、緩解疲勞、延緩衰老等功效。當(dāng)?shù)夭孛癯⑵鋾癯筛墒秤茫跃徑忸^暈頭痛等高原反應(yīng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，芫根提取液灌胃可明顯降低小鼠血清乳酸水平，增加乳酸脫氫酶活性，同時(shí)影響HIF-1α的表達(dá)。本文擬從RACK1/HIF-1α 通路初步探究芫根對(duì)膿毒癥小鼠認(rèn)知功能的改善作用，為開(kāi)發(fā)芫根藥用價(jià)值提供初步的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

芫根提取液是阿壩州新鮮芫根交由四川小葉本草生物科技有限公司加工提取而成，LPS（Sigma，美國(guó)），生理鹽水（科倫，中國(guó)），BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國(guó)上海），RACK1 鼠單克隆抗體（CST，美國(guó)，稀釋比 1:1000），HIF-1α 兔單克隆抗體（Immunoway，美國(guó)，稀釋比1:1000），β-Actin 鼠單克隆抗體（CST，美國(guó)，稀釋比1:1000），辣根酶標(biāo)記羊抗免IgG（中杉金橋，中國(guó)，稀釋比1:10000），辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（中杉金橋，中國(guó)，稀釋比1:10000），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore, Billerica, MA，USA）。

1.1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)KM 雄性小鼠21 只，6-8 周齡，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（中國(guó)，成都），飼養(yǎng)于5 個(gè)獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中，光暗循環(huán)12:12，溫度22℃、濕度55%。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組與模型的建立

將21 只雄性KM 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，根據(jù)體重隨機(jī)分為：對(duì)照組（n=4）：腹腔注射生理鹽水，模型組（n=8）：生理鹽水灌胃+腹腔注射LPS，治療組（n=9）：芫根灌胃+腹腔注射LPS。所有小鼠按照分組連續(xù)灌胃給藥，每日一次，每次灌胃量為20 mL·kg-1。灌胃結(jié)束后次日腹腔注射LPS 10 mg·kg-1建立膿毒癥小鼠模型。

1.2.2 腦組織病理學(xué)HE 檢測(cè)

連續(xù)灌胃給藥7 d 后，模型組及治療組各隨機(jī)抽取4 只小鼠腹腔注射LPS 構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，次日經(jīng)戊巴比妥鈉深度麻醉后取腦，置于4%多聚甲醛中固定48 h 后，依次等級(jí)脫水、石蠟包埋、蘇木素-伊紅（HE）染色。使用光學(xué)顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

剩余小鼠連續(xù)灌胃給藥14 d 后，LPS 腹腔注射構(gòu)建膿毒癥模型。造模后第7 d 進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。采用規(guī)格（100×100×40）cm 的曠場(chǎng)箱，平均分為25 份。將小鼠從中央?yún)^(qū)域放入曠場(chǎng)中心，記錄300 s 內(nèi)小鼠在中央、角落、四周區(qū)域的停留時(shí)間，以及總運(yùn)動(dòng)時(shí)間。中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間越長(zhǎng)，角落及四周停留時(shí)間越短，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)說(shuō)明小鼠抗焦慮能力越強(qiáng)。

1.2.4 蛋白提取及Western blotting

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠取腦，每克組織加入5 mL 裂解液（RIPA :PMSF=100 : 1）勻漿后置于冰上裂解30 min，隨后4°C、13000 g 離心10 min 收集上清，獲得總蛋白。使用BCA 試劑盒（凱基生物公司）測(cè)定蛋白濃度；經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、4°C 一抗孵育過(guò)夜、洗膜、二抗室溫孵育2 h、洗膜、曝光后，采用Quantity ONE 軟件以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，組別之間比較采用t檢驗(yàn)（Student's t test）分析；P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芫根對(duì)膿毒癥小鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡分布較均一；模型組小鼠與對(duì)照組相比：角落區(qū)域的停留時(shí)間及總靜止時(shí)間明顯增加，中央?yún)^(qū)域及四周區(qū)域停留時(shí)間減少；而與模型組相比，芫根治療組小鼠角落區(qū)域停留時(shí)間以及總靜止時(shí)長(zhǎng)明顯減少（P＜0.05），四周區(qū)域、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 芫根對(duì)膿毒癥小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

HE 染色顯示，對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞帶致密、整齊、均勻，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞層次欠清晰，細(xì)胞帶寬度變窄，細(xì)胞排列松散紊亂，形態(tài)異常，大量神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮濃染，界限不清；芫根治療組小鼠海馬神經(jīng)元排列較為緊密，層次清晰，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞核固縮濃染有不同程度減輕，見(jiàn)圖2。

圖1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定芫根對(duì)膿毒癥小鼠認(rèn)知功能的影響

圖2 芫根對(duì)膿毒癥小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響（HE 染色）

2.3 芫根對(duì)膿毒癥小鼠腦RACK1/HIF-1α 的調(diào)節(jié)作用

與對(duì)照組小鼠相比，LPS 誘導(dǎo)膿毒癥小鼠腦RACK1 蛋白水平明顯降低（P＜0.05），HIF-1α 蛋白水平增高；經(jīng)芫根灌胃后小鼠腦RACK1 蛋白水平相對(duì)模型組有所升高，而HIF-1α 的蛋白水平相對(duì)降低，見(jiàn)圖3。

圖3 芫根對(duì)膿毒癥小鼠腦RACK1/HIF-1α 的影響

3 討論

膿毒癥患者常出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥，因此認(rèn)知功能障礙患病率高，常出現(xiàn)注意力、記憶力下降以及焦慮、抑郁等情緒改變，影響患者正常的生活[10]。本研究采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)不同組別小鼠在曠場(chǎng)箱中不同位置的活動(dòng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠總運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯減少，但中央及四周區(qū)域的活動(dòng)相對(duì)增多，提示膿毒癥小鼠出現(xiàn)明顯的焦慮情緒，而給予芫根預(yù)處理后可在一定程度上改善小鼠的焦慮情緒，說(shuō)明芫根可能具有改善膿毒癥腦病認(rèn)知功能的作用。

海馬組織在大腦的學(xué)習(xí)和記憶等方面發(fā)揮著重要作用。基于嚙齒類動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)表明，腹側(cè)海馬體與情緒、壓力、情感有關(guān)，而背側(cè)海馬體則與學(xué)習(xí)、記憶、空間導(dǎo)航等相關(guān)[11]。因此腹側(cè)海馬病變的動(dòng)物可出現(xiàn)明顯的焦慮行為，如明暗探索測(cè)試中，從黑盒到白盒的速度更快，在噬食癥測(cè)試中，開(kāi)始進(jìn)食的速度更快等[12,13]。目前研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者海馬區(qū)明顯萎縮[14]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS 腹腔注射誘導(dǎo)膿毒癥后，小鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，大量神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死，這與之前的報(bào)道結(jié)果一致[15]；而經(jīng)芫根預(yù)處理后小鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞明顯減少，說(shuō)明芫根對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用。

本研究進(jìn)一步通過(guò)WB 測(cè)定膿毒癥小鼠腦RACK1 和HIF-1α 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔注射誘導(dǎo)膿毒癥后，模型組小鼠的RACK1 表達(dá)降低，與我們之前證實(shí)RACK1 在學(xué)習(xí)記憶的形成和維持以及情緒改變中至關(guān)重要再次吻合[16]；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)RACK1 所調(diào)控的 HIF-1α 表達(dá)升高，也與既往研究認(rèn)為RACK1 負(fù)性調(diào)控HIF-1α 一致[9]，然而由于本次實(shí)驗(yàn)樣本量有限，目前對(duì)于HIF-1α的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)未見(jiàn)差異、僅有趨勢(shì)，未來(lái)將通過(guò)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行證明。

經(jīng)芫根治療后膿毒癥小鼠腦RACK1/HIF-1α表達(dá)有所逆轉(zhuǎn)，但也因樣本數(shù)量的限制而未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但趨勢(shì)明顯。

綜上所述，芫根防治膿毒癥小鼠產(chǎn)生焦慮情緒的作用確切，其機(jī)制可能與調(diào)控RACK1/HIF-1α、保護(hù)海馬神經(jīng)元有關(guān)。未來(lái)將通過(guò)擴(kuò)大樣本量，增加糖代謝重編程等相關(guān)因子測(cè)定進(jìn)一步深入研究芫根的藥用價(jià)值。