急性肝胰腺壞死病病原菌毒力的初步研究

李吉云，沈 輝，孟慶國，萬夕和，蔣 葛，喬 毅，成 婕，馮艷琴,3，李浩瀾

( 1.南京師范大學 海洋科學與工程學院，江蘇 南京 210000；2.江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007；3.江蘇海洋大學 海洋科學與水產學院，江蘇 連云港 222000 )

急性肝胰腺壞死病作為一種新興蝦類疾病，自2009年我國海南省暴發以來，至今仍對全球對蝦養殖業產生嚴重影響[1]。2012年，亞太水產養殖聯盟因病蝦表現出獨特的肝胰腺壞死癥狀，將該病命名為急性肝胰腺壞死病。起初，部分學者認為，該病的發生與黃頭病毒[2]、對蝦種質[3]、養殖環境惡化[4]等因素有關。2015年，Tran等[5]通過試驗確定了該病的病原為一類特異的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，這類特異的副溶血弧菌通過編碼二元毒素pirA和pirB而具有致病性[6]；Lee等[7]通過基因重組和敲除pirA和pirB毒力基因獲得突變株進行試驗，進一步證明這兩種毒素蛋白是引起急性肝胰腺壞死病的主要致病因子。組織病理學顯示，發生急性肝胰腺壞死病的病蝦肝胰腺小管上皮細胞脫落，大量血細胞浸潤其中[8]。此外，致病性副溶血弧菌還能感染三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)等甲殼類動物[9]。

迄今為止，研究發現被致病性副溶血弧菌感染的蝦出現了不同死亡率。墨西哥株M1-1感染的蝦呈現亞急性死亡，與其他2株泰國株3HP和5HP相比，死亡率較低[10]，致病機理尚未明確。本實驗室對江蘇省不同地區暴發急性肝胰腺壞死病的養殖場調查后發現，發生此病的不同養殖對蝦群體出現了急性和亞急性兩種病程，分析認為，不同致病性副溶血弧菌菌株間可能存在毒力差異。因此，筆者通過攻毒試驗驗證不同致病性副溶血弧菌對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的毒力強弱，并利用多位點序列分型技術對收集的菌株進行分型研究，為急性肝胰腺壞死病的積極防控提供實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用急性肝胰腺壞死病致病性菌株分離源為2016—2017年江蘇省發生急性肝胰腺壞死病的對蝦樣品(表1)，按照SC/T 7103—2008《水生動物產地檢疫采樣技術規范》規定方法采集對蝦樣品。

表1 致病性副溶血弧菌來源信息Tab.1 Information on pathogenic V. parahaemolyticus source

試驗用凡納濱對蝦均取自南通市某養殖場，挑選健康、活躍、規格一致的凡納濱對蝦，體長(3.0±0.5) cm，體質量(2.79±0.50) g，未檢出致病性副溶血弧菌特定病原。

1.2 試驗設計

1.2.1 菌株培養與核酸提取

菌株接于硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養基上，37 ℃培養20 h，挑取單菌落接種至LB固體培養基上繼續37 ℃過夜培養。使用接種環挑取LB固體培養基單菌落于100 mL無菌雙蒸水中，沸水煮浴10 min后，12 000 r/min離心(離心半徑1 cm)5 min，取上清液為菌株DNA擴增模板。

1.2.2 菌株病原菌鑒定與確認

采用AP1、AP2上、下游引物進行PCR擴增，擴增引物序列見表2。其中AP1、AP2擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min，30次循環；72 ℃延伸10 min。采用16S rRNA基因通用引物27 F/1492 R為上、下游引物，進行PCR擴增，引物序列見表2。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35次循環；72 ℃延伸10 min。分別取5 μL擴增產物用于2%瓊脂糖凝膠電泳以便觀察目標條帶是否出現，余下產物16S rRNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果進行BLAST序列比對分析。

表2 PCR擴增片段及引物序列Tab.2 PCR amplification fragment and primer sequences

1.2.3 菌株攻毒回感試驗

試驗于50 L藍色塑料水箱中進行，每個水箱放養凡納濱對蝦30尾，水量20 L，鹽度6，水溫24～26 ℃，正常充氣，日投餌2次，暫養3 d后進行回感試驗。為排除LB液體培養基對試驗干擾，試驗設置2個對照組，分別為海水對照組和添加LB液體培養基的海水對照組，對照組設置2個平行，處理組均設置3個平行。通過浸浴方式進行感染，致病性副溶血弧菌密度為1×107cfu/mL[13]。攻毒后，隔6 h撈出死亡蝦，計數。死亡蝦經液氮速凍處理后-80 ℃保存。

1.2.4 多位點序列分型目的基因的選擇和引物合成

以1.2.1的上清液為菌株DNA擴增模板，通過PCR分別擴增致病性副溶血弧菌的recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC和tnaA共7對管家基因，隨后對PCR產物分別進行測序[14]。7對管家基因多位點序列分型引物合成參考PubMLST數據庫(表3)。

表3 致病性副溶血弧菌7對管家基因引物Tab.3 Seven primers of housekeeping genes in pathogenic V. parahaemolyticus

1.2.5 管家基因的擴增體系及條件

PCR反應體系(50 μL)：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水19 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；96 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 測序及數據分析

測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，測序結果用BioEdit軟件和DNAMAN軟件處理后，上傳至PubMLST副溶血弧菌數據庫(https://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)比對，獲得各管家基因位點的等位基因數值，并形成相應的等位基因譜，提交多位點序列分型網站，確定致病性副溶血弧菌的序列型(ST)[15]。

1.2.7 多位點序列分型結果及序列型特征分析

在pubMLST副溶血弧菌數據庫等位基因檢索項(https://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)中檢索統計與新的序列型ST2355相近的序列型。統計比對各管家基因突變率[16]，并與文獻中報道的各個地區的致病性副溶血弧菌做進化關系分析。

1.2.8 系統發育分析

采用MEGA 7.0軟件對不同致病性副溶血弧菌的序列型對應的7個管家基因拼接序列建立系統發育樹，以此分析不同序列型菌株的相互關系[17]。為評估系統發育樹中節點的穩定性，執行1000次重復自我檢驗。

1.3 數據處理

采用SPSS 26.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析及LSD法多重比較，采用Excel繪制折線圖。試驗數據均用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 菌株病原菌的鑒定結果

通過AP1、AP2引物擴增6株菌的AP1與AP2基因序列，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。6株菌在700 bp大小處有明顯條帶，與目標條帶大小一致。將測序結果與美國國家生物技術信息中心網站中已登記的16S rRNA基因序列進行比較分析，結果顯示，6株菌與致病性副溶血弧菌的相似性最高，相似性均在99%以上，表明以上分離得到的6株菌均屬于致病性副溶血弧菌。

圖1 6株菌毒力基因PCR檢測結果Fig.1 Dection of virulence genes of six strains by PCRa.AP1引物擴增；b.AP2引物擴增；M.DL1000 bp DNA標志物；1.SHY1669;2.SHY1673;3.SHY1697;4.SHY1776;5.SHY1777;6.SHY1833.a.amplification of primer AP1;b.amplification of primer AP2;M.DL100 DNA maker;1.SHY1669;2.SHY1673;3.SHY1697;4.SHY1776;5.SHY1777;6.SHY1833.

2.2 攻毒回感試驗結果

攻毒6 h后，試驗組凡納濱對蝦出現典型急性肝胰腺壞死病癥狀，如攝食緩慢、拖便、肝胰腺腫脹。死亡個體蝦出現空腸空胃、肝胰腺顏色變淡，檢測確認為致病性副溶血弧菌陽性。6株致病性副溶血弧菌感染凡納濱對蝦24 h后，對蝦開始出現死亡現象(圖2)。試驗過程中，菌株SHY1673、SHY1697試驗組致死速率較緩慢，攻毒96 h凡納濱對蝦總死亡率小于30%；反之，菌株SHY1669、SHY1776及SHY1777在12 h時致凡納濱對蝦出現死亡，表現出較高的死亡速率，24 h內對蝦大量死亡，96 h死亡率達80%以上。對照組均未出現對蝦死亡情況。將72 h內死亡率達到50%以上判定為急性死亡，未達到50%死亡率但出現死亡個體則判定為亞急性死亡。依據試驗結果，將菌株SHY1673、SHY1697歸類為亞急性菌株，將菌株SHY1669、SHY1776、SHY1777、SHY1833歸類為急性菌株。

圖2 不同致病性副溶血弧菌感染凡納濱對蝦96 h累計死亡率Fig.2 The 96-hour cumulative mortality of Pacific white shrimp L. vannamei infected by different VPAHPNDSN1.海水對照組；N2.添加LB液體培養基的海水對照組.N1.seawater control group；N2.seawater control with LB liquid medium.

2.3 致病性副溶血弧菌管家基因擴增結果

采用經過優化的退火溫度分別擴增致病性副溶血弧菌7個管家基因位點，結果顯示均可擴增(圖3)，電泳分析均出現目的條帶，經檢驗各擴增產物核酸濃度及純度符合測序要求，可用于多位點序列分型的后續分析研究。

圖3 致病性副溶血弧菌的MLST管家基因擴增結果Fig.3 MLST amplification results of pathogenic V. parahaemolyticusM.2000 bp DNA標志物;1.dnaE基因;2.gyrB基因;3.recA基因;4.dtdS基因;5.pntA基因.6:pyrC基因;7.tnaA基因.M.2000 bp Marker;1.dnaE gene;2.gyrB gene;3.recA gene;4.dtdS gene;5.pntA gene.6:pyrC gene;7.tnaA gene.

2.4 致病性副溶血弧菌多位點序列分型結果

將等位基因譜提交至pubMLST副溶血弧菌數據庫，比對結果見表4。6株致病性副溶血弧菌中有5株菌為已知序列型，菌株SHY1833為新序列型，其各管家基因均為已知等位基因型，但按順序拼接得到的等位基因組合在數據庫中無已知的序列型，提交至數據庫，現已將其收錄，并確認新序列型ST2355。

表4 6株致病性副溶血弧菌多位點序列分型結果Tab.4 Multilocus sequence typing(MLST) results of 6 strains of pathogenic V. parahaemolyticus

進一步研究分析新序列型ST2355的序列特異性，發現數據庫中ST1743與ST2355相似度最高，僅與dnaE等位基因存在差異，且只有2個突變位點(表5)，相似性高達99%。

表5 多位點新序列型ST2355等位基因突變位點信息(與ST1743比較)Tab.5 Genetic diversity at the seven loci examined of the new sequence type (comparied with ST1743)

將本試驗6株致病性副溶血弧菌與文獻中報道的各個地區的12株不同致病性副溶血弧菌用7個管家基因拼接序列生成進化樹(圖4)。結果顯示，所選菌株均分離自凡納濱對蝦或土壤環境中，序列型分別為ST313、ST314、ST315、ST394、ST395、ST760、ST764、ST1394、ST1576。從進化關系可以發現,所選18株致病性副溶血弧菌序列型可分為3個類群(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，其中有16株主要分布在Ⅰ和Ⅱ類群內。急性、亞急性2種序列型在3個類群中均有分布：亞急性序列型主要分布在中國、菲律賓等亞洲地區；急性菌株序列型則分布在美國、泰國、中國、菲律賓，分布范圍由亞洲延伸至北美洲。

圖4 多位點序列分型不同序列型進化關系Fig.4 The evolutionary relationship among the different sequence types加粗字體為本試驗所用菌株序列型.Sequence type of the strain used in this study is shown in bold font.

3 討 論

3.1 回感試驗差異性分析

截至目前，已有許多致病性副溶血弧菌的序列及引起不同死亡率的研究被報道。Lai等[18]在2015年對致病性副溶血弧菌的致病機理進行研究時發現，泰國株(5HP)的毒力顯著高于分離的越南株(M1-1、M2-36)。Phiwsaiya等[19]也報道了一株具有pVA1質粒，但致死率僅有50%的致病性副溶血弧菌。在本試驗中，浸浴攻毒96 h后，菌株SHY1776致凡納濱對蝦死亡率可達100%，而菌株SHY1673死亡率低于5%，存在顯著差異(P<0.05)，由此表明，菌株存在急性致死型和亞急性致死型，也進一步驗證了在中國各地的致病性副溶血弧菌中也存在不同毒力的現象。甄曉然等[20]發現，同一株拮抗菌對14株致病性副溶血弧菌的拮抗效果不同，這表明致病性副溶血弧菌株間差異明顯。致病性副溶血弧菌通過水平基因轉移重組，產生質粒編碼的PirA、PirB毒力蛋白，獲得毒力致病性[21]。對致病機制的深入研究發現，致病性副溶血弧菌(M2-36)菌株缺失pirB基因后不合成PirA及PirB毒素，也不具有致病性；致病性副溶血弧菌(M1-1)盡管具有pirA及pirB基因，也合成PirA及PirB毒素，但感染對蝦后其基本定殖在胃中，很少定殖在肝胰腺中，其毒力引起的致死率也較低。Kumar等[10]對致病性副溶血弧菌M1-1菌株進行深入研究后發現，M1-1菌株在培養基中培養2～3周后，盡管其pVA1質粒還存在，但其pirA/B基因已經丟失，并通過基因組測序發現，M1-1菌株比典型的致病性副溶血弧菌(5HP)菌株多了一些額外的基因，包括DNA代謝、壓力感應、噬菌體DNA復制蛋白等，但其毒力減弱的分子機制還需進一步探討。筆者在此基礎上進一步推測，致病性副溶血弧菌所表現出的廣泛多樣性可能歸因于通過水平轉移獲得攜帶基因的質粒的能力。在同種養殖條件下，不同株型的菌株在毒力產生能力上存在強弱之分，可能是因為養殖范圍流通，使得菌株在養殖條件中不斷轉化成為適應環境的亞急性毒株，而其中一些菌株進一步通過質粒轉移，逐漸突變成生命力頑強、更適應環境的急性菌株。此因素導致急性菌株與亞急性菌株在不斷地轉化，而目前已有的淡水養蝦模式與海水養蝦模式促使不同鹽度之間弧菌的交流轉化，可能存在造成有毒種群的風險，對水產養殖和人類健康產生一定影響。

另外，相關研究發現，致病菌的毒力會因為質粒間插入成簇規律間隔短回文重復序列而減弱，因為質粒間插入成簇規律間隔短回文重復序列會形成原噬菌體等外源DNA侵入的防御屏障，從而降低其致病性[22-23]。Yu等[24]通過對不同毒力大小的致病性副溶血弧菌進行基因組分析，發現缺少質粒間插入成簇規律間隔短回文重復序列會為原噬菌體通過基因水平轉移插入毒力基因從而增強致病性副溶血弧菌的毒力提供條件，以此推斷原噬菌體和質粒間插入成簇規律間隔短回文重復序列之間關系可能與致病性副溶血弧菌的毒力變化有一定關系，質粒間插入成簇規律間隔短回文重復序列的存在可能使菌株的毒力降低或消失。

3.2 分型結果分析

目前致病性副溶血弧菌分布于多個國家，菌株材料收集范圍較廣，將不同地區菌株信息進行比較分析存在一定難度，并且通過全球范圍的水產品貿易，副溶血弧菌污染和耐藥情況嚴重[25-26]。多位點序列分型可以將多個管家基因序列拼接，并與不同地區的同種類型菌株流行病學以及親緣進化關系分析比較，在分析生物學中具有一定的優越性。孫明玉等[16]對致病性副溶血弧菌進行多位點序列分型聚類分析，未發現全球不同地區的菌株在遺傳親緣關系上有明顯的分類性；泰國學者基于多位點序列分型的研究表明，致病性副溶血弧菌分布較廣，但非成群分布，具有遺傳多樣性[26]，但在地域上未表現出明顯的親緣關系；Yu等[24]對34株致病性副溶血弧菌進行多位點序列分型分析，發現ST970作為優勢菌株最為常見。本試驗中，對6株菌以及不同地區致病性副溶血弧菌進行多位點序列分型研究，結果顯示，江蘇不同地區收集到的6株致病性副溶血弧菌中5株為已知序列型，分別為ST452、ST882、ST415、ST114、ST919，具有較高的分布多樣性，且與ST970屬于2個不同的集群，分布距離較遠。筆者還發現，ST2355與數據庫中ST1743同源性最高，相似性超過99%。由此推測這2株菌可能是來自于同一亞急性祖先或是由同一個亞急性菌株突變產生。本試驗多位點序列分型聚類結果還顯示，中國致病性副溶血弧菌的遺傳多樣性較高，多株與泰國、菲律賓、馬來西亞等東南亞國家聚在一起，初步表明我國對蝦養殖活動與東南亞國家交流緊密。Restrepo等[27]通過基因組測序也發現，南美洲致病性副溶血弧菌相比于墨西哥菌株，其基因相似性與東南亞菌株更高，由此也提出了急性肝胰腺壞死病防控的預警建議。

另外，由本試驗多位點序列分型聚類分析結果可見，不同毒力的致病性副溶血弧菌并未從親緣關系上顯示出強弱差異聚類趨勢。這一結果與Yu等[24]研究結果一致，在多位點序列分型分析中，致病性副溶血弧菌并未按毒力的強弱程度進行聚類，推測是因為致病性副溶血弧菌毒力強弱的差異是表現在質粒基因差異性上[18]，而多位點序列分型系統發育樹分析主要體現在菌株致病性副溶血弧菌不同地理種群的差異性上[24]。由此表明，多位點序列分型不能有效區分高度相關、不同血清型但遺傳關系相近的菌株[28]。

另外，筆者僅選擇江蘇地區的6株致病性副溶血弧菌與其他各地的9株致病性副溶血弧菌進行比較，存在一定的局限性，不能完全反映不同類型致病性副溶血弧菌的遺傳關系。在野外條件下引起菌株變異和差異的情況很多，如藻毒素的影響、環境的惡化均可導致對蝦不同的死亡率，所以筆者選擇在統一的試驗條件下，驗證凡納濱對蝦感染菌株后死亡率的差異性。本試驗中的多位點序列分型提示，致病性副溶血弧菌并不是來自一個單一的遺傳譜系，出現了1個新的序列型，豐富了數據庫的信息。在今后的研究中，筆者會繼續從比較基因組學、毒力因子和毒力蛋白等方面繼續進行差異原因的探索，為致病性副溶血弧菌的致病機制研究提供思路，以便于后期急性肝胰腺壞死病的防控診斷。

4 結 論

本試驗結果顯示：不同致病性副溶血弧菌在感染凡納濱對蝦引起急性肝胰腺壞死病時，會由于毒力大小差異，出現急性與亞急性兩種類型；多位點序列分型顯示，毒力不同的菌株從親緣關系上不能表現出強弱差異聚類趨勢。