青蛤I型溶菌酶在畢赤酵母中的重組DNA表達(dá)

馮付靄，趙 震，陶 妍,2，謝 晶,2，錢韻芳,2

( 1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306 )

溶菌酶在大多數(shù)生物先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其主要包括植物、動物和微生物來源的溶菌酶[1]；而動物來源的溶菌酶則可分為雞型(C型)、鵝型(G型)和無脊椎動物型(I型)，其中研究最多、最具代表性的是C型，即雞蛋清中的天然C型溶菌酶。水產(chǎn)動物溶菌酶的研究起步較晚，但因其特殊的作用機(jī)理及其在動物免疫中的重要作用而越來越受到關(guān)注[2]。魚類等脊椎動物中僅存在C、G型溶菌酶，而貝類等無脊椎動物中3種類型溶菌酶均存在[3]。三者之間在一級結(jié)構(gòu)上存在較大差異，C型溶菌酶含保守的8個半胱氨酸殘基，魚類G型溶菌酶大多數(shù)缺乏半胱氨酸殘基；而I型溶菌酶含多至14個的半胱氨酸殘基，以致在空間上可形成7對二硫鍵而賦予其結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性[4-5]。自1975年Jollès等[6]從海星Asteriasrubens中分離出第一個I型溶菌酶以來，已從斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[7]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[8]、青蛤(Cyclinasinensis)[9]、剃刀蛤(Sinonovaculaconstricta)[10]和文昌魚(Branchiostomajaponicum)[3]等無脊椎動物中克隆到I型溶菌酶基因。

曾有學(xué)者對文昌魚施行鰻弧菌(Vibrioanguillarum)挑戰(zhàn)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其鰓中C型和G型溶菌酶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平并無明顯變化，但I(xiàn)型溶菌酶的轉(zhuǎn)錄水平在24 h后明顯提高[3]；有研究顯示，將菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)置于人為設(shè)置的鰻弧菌污染的養(yǎng)殖環(huán)境中，其I型溶菌酶基因在血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高[11]；此外，當(dāng)剃刀蛤在有副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)的環(huán)境中生長時，其鰓和肝胰腺中I型溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加[10]。由此可以確定I型溶菌酶是無脊椎動物的重要蛋白質(zhì)免疫因子，因此其可以成為開發(fā)天然抗菌劑的良好候選者。曾有學(xué)者構(gòu)建了剃刀蛤和仿刺參的I型溶菌酶的原核表達(dá)系統(tǒng)，最初獲得的是無活性的表達(dá)產(chǎn)物，對其進(jìn)行基于尿素透析的復(fù)性處理后才使其顯示部分活性[10,12]；另有學(xué)者通過巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)獲得克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的重組I型溶菌酶，其顯示了抗多種細(xì)菌的生物學(xué)活性[13]。

青蛤是我國沿海重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一，其作為濾食性的水產(chǎn)生物，具有較強(qiáng)的抗逆能力。研究表明，在有鰻弧菌的養(yǎng)殖環(huán)境中生長的青蛤，其體內(nèi)的某些溶菌酶的轉(zhuǎn)錄水平會明顯提高[9]。對其C型溶菌酶基因進(jìn)行了cDNA克隆及基于重組畢赤酵母的生物合成研究，發(fā)現(xiàn)重組C型溶菌酶具有良好的抑菌活性和穩(wěn)定性[14]。然而，關(guān)于青蛤I型溶菌酶的重組表達(dá)方面的研究尚未見報道。據(jù)此，筆者擬通過構(gòu)建重組畢赤酵母菌株，實(shí)現(xiàn)青蛤I型溶菌酶的分泌表達(dá)，旨在為無脊椎動物來源I型溶菌酶的制備提供重組DNA技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物、載體和菌株

青蛤來源于上海市魚港路海鮮市場；pMD-19T來源于日本TaKaRa公司；pPICZαA和畢赤酵母X-33來源于美國Invitrogen公司(pPICZαA屬穿梭載體，它含眾多限制性酶切位點(diǎn)以便于目的基因與其連接構(gòu)建重組載體；此外，它含有強(qiáng)誘導(dǎo)型醇氧化酶啟動子5′AOX1和分泌信號肽α-factor，前者可以利用甲醇表達(dá)任何外源基因，而后者能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白的持續(xù)分泌表達(dá))；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α來源于北京天根生物科技有限公司；試驗(yàn)細(xì)菌為副溶血性弧菌(ATCC17802)、大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC6538)。

1.1.2 主要試劑

RNAiso plus、Taq DNA 聚合酶、T4DNA連接酶和3種核酸內(nèi)切酶(Xba Ⅰ、Xho Ⅰ、Sac Ⅰ)來源于日本TaKaRa公司；Fastking cDNA第1鏈合成試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、膠上DNA和酵母基因組DNA以及質(zhì)粒提取的試劑盒來源于北京天根生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)來源于北京中科瑞泰生物科技有限公司；Western Blot試劑盒來源于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。DNA測序和PCR引物的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。用于培養(yǎng)細(xì)菌和畢赤酵母的所有培養(yǎng)基配方(LB、YPD、MM、MD、BMGY、BMMY)見畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)手冊(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增青蛤I型溶菌酶基因

新鮮青蛤采購后快速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，立即取其閉殼肌，按RNAiso Plus說明書提取總RNA。第1鏈cDNA的合成：2 μL總RNA、1 μL 3′ RACE Adaptor primer (5 μmol/L)、2 μL 5×Prime Script Buffer、1 μL dNTPs Mixture (10 mmol/L each)、0.25 μL RNase Inhibitor (40 U/μL)、0.25 μL Prime Script RTase (200 U/μL)、3.5 μL RNase-Free dH2O；先42 ℃ 60 min，再70 ℃ 15 min。

參考青蛤I型溶菌酶基因序列(GenBank登錄號：HQ651175)設(shè)計(jì)引物(表1)。以第1鏈 cDNA 為模板、F1和 R1為引物，通過PCR擴(kuò)增編碼青蛤I型溶菌酶的全長cDNA。PCR體系：1 μL 10×Taq Buffer、0.8 μL dNTPs(2.5 μmol/L each)、各 0.2 μL 的F1和R1(10 μmol/L)、0.1 μL第1鏈 cDNA、0.1 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)，調(diào)至總量10 μL。PCR程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。以pMD-19T為克隆載體，將第1次PCR產(chǎn)物與其連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后挑取白色菌落用于陽性克隆的篩選，入選的陽性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA測序。在此基礎(chǔ)上再分別以2對引物(F2、R2和F2、R3)(表1)進(jìn)行第2次和第3次PCR，以在5′端(Xho Ⅰ位點(diǎn)、Kex 2信號肽酶切位點(diǎn))和3′端(6×His標(biāo)簽、終止密碼子、Xba Ⅰ位點(diǎn))添加相關(guān)位點(diǎn)，反應(yīng)體系和程序同第1次PCR，退火溫度分別改為58.6 ℃和58.4 ℃。最終獲得的目的片段同上經(jīng)DNA測序后命名為青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因。經(jīng)ExPASy軟件(http：//web.expasy.org/compute.pi/)預(yù)測CslyI的分子質(zhì)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2 pPICZαA-CslyI和X-33/pPICZαA-CslyI的構(gòu)建

pMD-19T-CslyI經(jīng)Xba Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后獲得目的片段CslyI，按試劑盒說明書將其與pPICZαA連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-CslyI(圖1)，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α細(xì)胞后經(jīng)增殖培養(yǎng)、按照快速小提質(zhì)粒試劑盒說明書提取純化重組載體pPICZαA-CslyI，通過雙酶切、菌落PCR和DNA測序?qū)ζ溥M(jìn)行確證。雙酶切反應(yīng)體系：70 μL重組載體、10 μL 10×M Buffer、10 μL 0.1% BSA、5 μL Xho Ⅰ(15 U/μL)、4 μL Xba Ⅰ(10 U/μL)，37 ℃反應(yīng)8 h。

圖1 重組表達(dá)載體pPICZαA-CslyI的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant expression vector pPICZαA-CslyI

使用Sac Ⅰ對pPICZαA-CslyI進(jìn)行線性化酶切后，將其與畢赤酵母X-33按1∶8(體積比)混合，置于電轉(zhuǎn)杯中冰浴數(shù)分鐘后電擊5 ms (1.5 kV、25 μF、200 Ω)；加入1 mol/L的山梨醇1 mL，約1.5 h后加入YPD培養(yǎng)基1 mL于搖床培養(yǎng)1.5 h；菌體涂于含100 μg/mL博萊霉素YPD平板，于29 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑選長勢飽滿的酵母單菌落再依次接種至含1000 μg/mL博萊霉素MM、MD、YPD平板，經(jīng)培養(yǎng)后篩選優(yōu)質(zhì)的X-33/pPICZαA-CslyI酵母轉(zhuǎn)化子，并使用5′AOX 1和3′AOX 1(表1)對其基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。另外，同上方法構(gòu)建X-33/pPICZαA酵母轉(zhuǎn)化子作為陰性對照。

1.2.3 重組青蛤I型溶菌酶的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

于5 mL的YPD培養(yǎng)基中接種入優(yōu)質(zhì)的酵母轉(zhuǎn)化子后，28 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)16 h；轉(zhuǎn)接250 μL于50 mL的BMGY培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)48 h；菌體重懸于250 mL的BMMY培養(yǎng)基(含1%甲醇)中，再培養(yǎng)72 h。通過Tricine-SDS-PAGE分析離心后的培養(yǎng)液上清[4%濃縮膠、18%分離膠、9%三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)]。

Western blot分析按試劑盒說明書進(jìn)行：凝膠上的蛋白質(zhì)條帶被電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜后，加入封閉液8 mL反應(yīng)1 h；用1×TBST兩次洗膜后再分別與鼠單克隆抗體和山羊抗小鼠單克隆抗體反應(yīng)2 h和1 h；經(jīng)洗膜后使用HRP-DAB試劑盒對其顯色。由上海中科新生命生物科技有限公司對經(jīng)鎳離子親和層析純化后的重組蛋白進(jìn)行基于MALDI-TOF-TOF的序列分析。

1.2.4 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性及穩(wěn)定性測定

將培養(yǎng)至600 nm吸光值[D(600 nm)]為0.5的副溶血性弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別稀釋100倍后，按1∶100(體積比)與X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液于37 ℃作用2 h；然后取30 μL涂于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)至菌落長出。以X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液作為陰性對照。

另一方面，將40 μL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別注入96孔板中，加入經(jīng)100 ℃沸水浴保溫0、20、40、60 min的80 μL培養(yǎng)液上清液，于37 ℃孵育過夜后使用酶標(biāo)儀(BioTeK?，美國)測定D(600 nm)，以考察經(jīng)高溫處理不同時間后的培養(yǎng)液上清液對細(xì)菌的抑制作用[15]。每個試驗(yàn)組3個平行，使用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因的cDNA克隆

經(jīng)過3次PCR依次擴(kuò)增到590、516、528 bp的cDNA片段，最后的PCR產(chǎn)物為青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因(圖2)，其DNA測序結(jié)果見圖3，Xho Ⅰ和Xba Ⅰ 2個限制性位點(diǎn)、Kex 2信號肽酶切位點(diǎn)及6×His標(biāo)簽均被添加。除去這些位點(diǎn)，CslyI基因編碼了由162個氨基酸殘基組成的青蛤I型溶菌酶成熟肽，含有的14個保守半胱氨酸殘基可以在空間上形成7對二硫鍵以穩(wěn)定其空間結(jié)構(gòu)。經(jīng)分析，CslyI的理論分子質(zhì)量為19.97 ku，等電點(diǎn)為7.6。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR productsM.DNA標(biāo)記；1.第1次PCR擴(kuò)增片段；2.第2次PCR擴(kuò)增片段；3.第3次PCR擴(kuò)增片段.M.DNA marker;1.the first PCR amplification fragment;2.the second PCR amplification fragment;3.the third PCR amplification fragment.

圖3 目的基因CslyI的核苷酸及其推斷的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the target gene CslyI斜體指示Xho Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)；下劃線指示Kex 2信號肽酶切位點(diǎn)；陰影指示半胱氨酸殘基.Italics indicate Xho Ⅰ and Xba Ⅰ restriction sites;underline indicates Kex 2 signal cleavage site;cysteine residues are shaded.

2.2 pPICZαA-CslyI的鑒定及其X-33/pPICZαA-CslyI的篩選

以DH5α/pPICZαA-CslyI為模板，使用引物5′AOX1和3′AOX1對重組表達(dá)載體pPICZαA-CslyI進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增到1個約1000 bp的片段，與1030 bp的理論值相符(圖4a)。另一方面，使用Xho Ⅰ和 Xba Ⅰ對pPICZαA-CslyI進(jìn)行雙酶切后顯示，在略高于500 bp處有淡淡的條帶，與預(yù)期的528 bp相符(圖4b)。最終通過DNA測序證明目的基因CslyI已正確連接至pPICZαA表達(dá)載體。通過含1000 μg/mL博萊霉素的YPD平板篩選到5株高拷貝的X-33/pPICZαA-CslyI重組菌株，對它們的基因組DNA的驗(yàn)證結(jié)果顯示，5株重組酵母菌均擴(kuò)增到約1000 bp的片段(圖4c)，與預(yù)期的1030 bp相符。

圖4 pPICZαA-CslyI的菌落PCR(a)和雙酶切驗(yàn)證(b)及X-33/pPICZαA-CslyI的篩選(c)Fig.4 Identification of pPICZαA-CslyI by colony PCR (a) and digestion of two endonucleases (b) as well as screening of X-33/pPICZαA-CslyI (c)M.DNA標(biāo)記；1.PCR產(chǎn)物；2.雙酶切產(chǎn)物；3～7.含pPICZαA-CslyI的酵母轉(zhuǎn)化子；8.含pPICZαA的酵母轉(zhuǎn)化子.M.DNA marker;lane 1.PCR product;lane 2.pPICZαA-CslyI products digested by two endonucleases;lanes 3～7.yeast transformants containing pPICZαA-CslyI;lane 8.yeast transformant containing pPICZαA.

2.3 在畢赤酵母中表達(dá)重組蛋白

選擇6號菌株用于重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)，Tricine-SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖5a)：培養(yǎng)液上清液在靠近22.0 ku 處存在明顯條帶，基本接近重組蛋白的理論分子質(zhì)量19.97 ku，初步推測其為目的蛋白；其條帶位置偏上可能與待分析蛋白質(zhì)樣品變性不完全有關(guān)[16]，以下試驗(yàn)結(jié)果將進(jìn)一步證明此判斷。

圖5 重組菌株表達(dá)產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE(a)和Western blot(b)分析Fig.5 Tricine-SDS-PAGE (a) and Western blot (b) analysis for the recombinant strain productsM1.超低蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2.彩虹預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.含pPICZαA的酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液上清液；2.含pPICZαA-CslyI的酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液上清液.M1.ultra-low protein molecular weight marker;M2:rainbow pre-stained protein molecular weight marker;lane 1.culture supernatant of yeast transformant containing pPICZαA;lane 2.culture supernatant of yeast transformant containing pPICZαA-CslyI.

2.4 基于Western blot和MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜的表達(dá)產(chǎn)物鑒定

通過Western blot對X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液進(jìn)行分析，其為1個近25 ku的單一明顯雜交條帶，其分子質(zhì)量明顯高于理論分子質(zhì)量 19.97 ku(圖5b)，分析原因可能與使用的彩虹預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，即目的蛋白與顯色染料共價偶聯(lián)后，減慢了其在凝膠中的遷移速度，以致顯示的分子量變大，此現(xiàn)象在筆者之前的研究中也有出現(xiàn)。而X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液未出現(xiàn)任何雜交條帶。進(jìn)一步對表達(dá)產(chǎn)物的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在m/z1441.8～2727.4 之間捕獲到2個肽段：m/z為1499.7352的峰代表自N端起第143～155的肽段(GCKSGSTIGYWQR)(圖6)、m/z為2251.0564的峰代表自N端起第67～85的肽段(NVGCKMDIGSYSCGYFQIK)。兩者與推斷的氨基酸理論序列完全一致，證明了表達(dá)產(chǎn)物即為預(yù)期的重組青蛤I型溶菌酶。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析Fig.6 MALDI-TOF-TOF mass spectrometry analysis of the expressed products大寫字母指示氨基酸序列.Capital letters indicate amino acid sequences.

2.5 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性和穩(wěn)定性

基于平板涂布法的抑菌活性測定結(jié)果顯示，菌株X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌作用后，菌落數(shù)明顯少于陰性對照(X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液與細(xì)菌作用)(圖7)。另一方面，為了考察重組青蛤I型溶菌酶的熱穩(wěn)定性，將培養(yǎng)液上清液置于沸水浴中保溫不同時間后與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作用，保溫20、40、60 min后的培養(yǎng)液上清液仍然對上述2種細(xì)菌具有抑菌活性(圖8)，與陰性對照組差異不顯著(P>0.05)，表明青蛤I型溶菌酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖7 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of the recombinant protein CslyIin clam C. sinensis1.用X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液處理的細(xì)菌；2.用X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液處理的細(xì)菌.1.bacteria treated with X-33/pPICZαA culture supernatant;2.bacteria treated with X-33/pPICZαA-CslyI culture supernatant.

圖8 高溫處理對重組青蛤I型溶菌酶抑菌活性的影響Fig.8 Effect of high temperature on the antibacterial activity of recombinant CslyI in clam C. sinensis

3 討 論

3.1 影響重組青蛤I型溶菌酶表達(dá)量的因素

通過構(gòu)建青蛤I型溶菌酶的重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，首次獲得具有抑菌活性的重組青蛤I型溶菌酶，但表達(dá)量很低。可能有2個原因：(1)菌體接種量偏低。本次試驗(yàn)使用的培養(yǎng)基含酵母浸出物和優(yōu)質(zhì)蛋白胨，它較以前使用的無氨基氮源培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，更有利于菌體生長，故嘗試將菌體接種量減為0.5%；但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，減少接種量會影響重組青蛤I型溶菌酶的表達(dá)量。有研究表明，菌體接種量為2%～10%，隨著接種量的增加重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量會隨之增加[17]。(2)根據(jù)Graphical Codon Usage Analyser(http://www.gcua.schoedl.de)預(yù)測，筆者通過反轉(zhuǎn)錄PCR克隆的青蛤I型溶菌酶cDNA中存在19個對于畢赤酵母來說的低頻密碼子，該現(xiàn)象可能會影響重組蛋白質(zhì)的高效表達(dá)。有學(xué)者報道，其根據(jù)畢赤酵母的密碼子喜好優(yōu)化了納豆激酶成熟肽的基因nkD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用合成的優(yōu)化基因后使重組納豆激酶成熟肽的表達(dá)量提高了3.5倍[18]；另有學(xué)者對人源溶菌酶基因LYZop進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)其在牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量提高2.2倍，在牛成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量提高2.44倍[19]。綜上，進(jìn)一步的研究將關(guān)注于菌體的接種量和密碼子的優(yōu)化。

3.2 重組青蛤I型溶菌酶熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

有研究表明，二硫鍵的作用是疊加的，且引入二硫鍵突變體的蛋白質(zhì)的變性溫度較野生型蛋白質(zhì)高很多[20]。筆者對重組青蛤I型溶菌酶的熱穩(wěn)定性測定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 ℃處理60 min時，其抑菌活性較對照組并無明顯下降，證明重組青蛤I型溶菌酶具有良好的穩(wěn)定性。分析原因可能與其一級結(jié)構(gòu)中含多至14個的半胱氨酸殘基有關(guān)，經(jīng)SWISS MODEL在線軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)初步預(yù)測，這些半胱氨酸殘基在空間上通過7對二硫鍵將數(shù)個α-螺旋與無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)單元締合在一起，形成緊密的球狀蛋白質(zhì)而極大地穩(wěn)定了重組青蛤I型溶菌酶的結(jié)構(gòu)。也有學(xué)者將海參I型溶菌酶置于85 ℃水浴中保溫50 min，發(fā)現(xiàn)其仍具有80%的相對酶活性[21]。

3.3 基于重組青蛤I型溶菌酶特性的應(yīng)用展望

就目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和食品安全而論，綠色無抗生素飼料的應(yīng)用必將成為主要的趨勢，因此，具有良好熱穩(wěn)定性的重組青蛤I型溶菌酶極具開發(fā)和使用價值。飼料生產(chǎn)中餌料的制作一般須經(jīng)歷原料的粉碎、機(jī)械化處理和顆粒化或壓塊等過程[22]，這些過程必然會伴隨溫度的上升，而熱穩(wěn)定性良好的重組青蛤I型溶菌酶則能夠抵抗高溫的影響，從而成為水產(chǎn)飼料添加劑的極佳候選者。此外，含重組青蛤I型溶菌酶的培養(yǎng)液上清液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌具有良好的抑菌活性，預(yù)示了大規(guī)模制備時對培養(yǎng)液上清液無需進(jìn)行純化即可將其作為生產(chǎn)天然抗菌劑的原液，這既簡化了工業(yè)上的操作流程，也節(jié)約了生產(chǎn)成本。

4 結(jié) 論

通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得編碼青蛤I型溶菌酶的成熟肽基因CslyI，并成功構(gòu)建了X-33/pPICZαA-CslyI畢赤酵母重組菌株；該菌株于28 ℃、250 r/min、1%甲醇、72 h的發(fā)酵條件下，成功表達(dá)重組青蛤I型溶菌酶；經(jīng)抑菌試驗(yàn)證明，重組青蛤I型溶菌酶具有明顯的抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌的活性，并在高溫下顯示良好的穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果可為無脊椎動物來源I型溶菌酶的制備提供基于重組畢赤酵母的生物合成技術(shù)。