瀾滄裂腹魚4個地理群體遺傳多樣性分析

金方彭，左鵬翔，冷 云，吳俊頡，熊合勇，高海濤，雷春云，周 睿，李光華

( 1.云南省漁業科學研究院，云南 昆明 650000；2.華能瀾滄江水電股份有限公司，云南 昆明 650000 )

瀾滄裂腹魚(Schizothoraxlantsangensis)，俗稱面魚，屬鯉形目鯉科裂腹魚亞科裂腹魚屬，為高原山區冷水性魚類，分布于瀾滄江中上游。分布區較狹窄，數量不多，已列為《中國物種紅色名錄第一卷》瀕危物種[1]。近年來，由于瀾滄江梯級水電站的開發建設導致流域出現片段化，阻礙了瀾滄裂腹魚的自然繁殖，導致自然資源量下降，而通過人工繁殖的方法進行資源量恢復的效果尚不明顯。目前，國內外對瀾滄裂腹魚的研究較少，主要集中在繁殖生物學[2]、肌肉營養[3]等方面，有關瀾滄裂腹魚遺傳多樣性方面的報道較少。以高通量測序為基礎的簡化基因組測序(SLAF-seq)技術具有通量高、有效讀長長、準確度高、重復性好、成本低等特點[4]。馬海鑫[5]基于SLAF-seq技術對弧唇裂腹魚(S.curvilabiatus)進行了群體遺傳學分析，王鳳嬌等[6]基于SLAF-seq技術對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)3個選育世代進行了遺傳多樣性分析，金方彭等[7]利用SLAF-seq技術對瀾滄江中上游光唇裂腹魚(S.lissolabiatus)4個地理群體進行了遺傳多樣性分析。筆者利用SLAF-seq技術獲得大量特異性單核苷酸多態性標簽，并利用開發的位點分析不同地理群體樣品的遺傳多樣性，為瀾滄裂腹魚未來的種質選育提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在瀾滄江中上游采集瀾滄裂腹魚野生群體40尾，劃分為4個地理群體(表1)。取野生樣本尾鰭，存放于無水乙醇中帶回實驗室后于-85 ℃冰箱保存。

表1 瀾滄裂腹魚樣本采集點Tab.1 Sample collection sites of S. lantsangensis

1.2 DNA提取

采用異丙醇沉淀法，提取樣本DNA。純化后的DNA樣品經瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計[D(260 nm)/D(280 nm)]檢測合格。

1.3 建庫及高通量測序

根據Sun等[8]方法構建SLAF-seq文庫，筆者選取錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)基因組作為酶切預測的參考基因組，其基因組大小為1.71 Gb，GC含量37.00%(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/951/615/GCF_000951615.1_common_carp_genome/GCF_000951615.1_common_carp_genome_genomic.fna.gz)，內切酶的選擇原則是避免重復序列的內切酶片段且片段必須均勻地分布在基因組中，并使酶切片段數符合預期特異位點片斷(SLAF)標簽數。操作流程為:在酶切片段3′端加poly (A)、連接Dual-index專用測序接頭、PCR擴增、純化、混樣、切膠回收目的片段，并將目的片段使用Illumina Hiseq 2500進行雙末端測序。選用日本晴水稻(Oryzasativassp.japonica)基因組(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)為對照組，并將同一過程進行排序以評估建庫的準確性。

根據序列相似性特點，將各樣品的讀長進行聚類，聚在一起的讀長來源于一個SLAF標簽。不同SLAF標簽間的相似度遠低于同一SLAF標簽在不同樣品間的序列；一個SLAF標簽在不同樣品間序列有差異，即可定義為多態性SLAF標簽。單核苷酸多態性(SNP)標記的開發是以每個 SLAF 標簽中測序深度最高的序列類型作為參考序列，利用BWA[9]將測序讀長比對到參考基因組上，并使用SAMtools[10]和GATK[11]方法開發SNP標記，最終以2種方法得到的SNP標記交集作為可靠的SNP標記數據集，利用群體內具有代表性的高質量SNP標記進行群體多態性分析。

1.4 數據處理

核酸多樣性分析和4個群體間的遺傳分化指數使用PopGenome[12]軟件統計；遺傳多樣性參數和群體間分子變異分析使用Arlequin[13]軟件統計；使用MEGA X[14]軟件，基于鄰接法，采用Kimura 2-parameter模型，構建各樣品的系統發育樹；通過admixture[15]軟件，進行群體遺傳結構分析；通過EIGENSOFT[16]軟件，進行主成分分析，得到樣品的聚類情況。

2 結果與分析

2.1 基礎數據

2.1.1 建庫評估與質控

通過錦鯉基因組進行方案預測，選擇Rsa Ⅰ+Hae Ⅲ酶對瀾滄裂腹魚進行酶切，目標片段長度為364～414 bp，樣本平均獲得129 637個SLAF標簽，SLAF標簽在基因組上基本分布均勻，為保證項目分析質量，本項目采用讀長126 bp×2作后續的數據評估和分析，共獲得467.67 Mb讀長數據，Control數據雙端比對效率為97.19%，酶切效率為90.82%，測序Q30堿基含量平均為94.88%，GC含量平均為40.32%，所得到的Q30堿基質量值較高，說明堿基出錯率低，測序結果可靠。讀長比對率均大于70%，表明試驗過程沒有污染，插入片段長度呈正態分布(圖1)，建庫正常。

2.1.2 SLAF標簽與SNP標記開發

研究獲得498 199個SLAF標簽，其中多態性SLAF標簽有213 644個，標簽的平均測序深度為29.36×。以每個SLAF標簽中深度最高的序列類型作為參考序列，將測序讀長比對到參考基因組上，共獲得736 515個群體SNP位點，其中：SNP的完整度為3.48%～58.54%，平均為36.64%；SNP雜合度為4.03%～21.47%，平均為15.51%(表2)。

表2 瀾滄裂腹魚SLAF標簽和SNP信息Tab.2 SLAF labels and SNP information of S. lantsangensis

2.2 遺傳多樣性分析

過濾掉4個群體中完整度小于0.5、第2等位基因頻率小于0.05的SNP，用過濾后的SNP計算出各采樣點的遺傳多樣性指數。4個地理群體的觀測等位基因數、期望等位基因數、觀測雜合度和期望雜合度(基因多樣性)、根井正利基因多樣性指數、香農—維納多樣性指數、多態信息含量均是黃登—大華橋地理群體最高(1.9653、1.5725、0.5032、0.3322、0.3430、0.4980、0.2655)；次要基因頻率以苗尾—功果橋群體最高(0.2724)(表3)。對不同地理群體的觀測等位基因數、期望等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度、根井正利基因多樣性指數、香農—維納多樣性指數、多態信息含量(PIC)作顯著性差異分析，結果顯示，F(664.6)>Fcrit(2.660)且P(-8.94)<0.05，呈顯著差異。

表3 瀾滄裂腹魚4個地理群體遺傳多樣性指數Tab.3 Genetic diversity index of four geographical populations of S. lantsangensis

2.3 群體間遺傳分化分析

2.3.1 群體間遺傳距離

使用MEGA X 10.0.5軟件計算群體間的遺傳距離，所有樣品的遺傳距離為0.0323～0.8387，群體間遺傳距離為0.1946～0.6235。群體間遺傳分化指數計算結果(表4)表明，黃登—大華橋、苗尾—功果橋的分歧最大(0.0817)，黃登—大華橋、烏弄龍群體分歧最小(-0.0097)，平均為0.0242。平均顯著水平P=0.2098>0.05，F(1.89)

表4 瀾滄裂腹魚遺傳分化指數和遺傳距離Tab.4 Genetic differentiation index and genetic distance of S. lantsangensis

2.3.2 群體聚類分析

從系統發育樹來看，黃登—大華橋群體聚成一支，里底群體聚為一支，苗尾—功果橋群體聚為一支，烏弄龍和其他地理群體有交叉聚類的現象(圖2)。總的看來，各地理群體的樣本有交叉聚類的現象。

圖2 對照序列插入片段分布Fig.2 Distribution of insert fragments of control sequences

圖2 瀾滄裂腹魚系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of S. lantsangensis

2.3.3 不同群體之間分子變異分析

對4個地理群體的瀾滄裂腹魚的控制區序列進行分子生物學方差分析(AMOVA)，結果顯示，群體遺傳分化指數0.02915(P=0.00348<0.01)，表明瀾滄裂腹魚群體間存在小的但差異顯著的遺傳分化。其中群體間變異占2.91%，群體內的變異占97.09%，表明這些樣品的遺傳分化主要發生在群體內部(表5)。

3 討 論

3.1 瀾滄裂腹魚遺傳多樣性分析

多態性信息含量可以反映出位點在群體中的多樣性水平：當多態性信息含量>0.5時，為高度多態性位點；當0.25<多態性信息含量<0.5時，為中度多態位點；當多態性信息含量<0.25時，為低度多態位點[17]。本研究中，瀾滄裂腹魚不同地理群體的多態性含量大小依次為黃登—大華橋(0.265)>里底(0.2499)>烏弄龍(0.2463)>苗尾—功果橋(0.1709)，除黃登—大華橋地理群體呈中度多態性外，其他3個地理群體均呈低度多態性。

雜合度是群體在所檢測位點上的雜合子頻率，可以衡量一個群體雜合程度的高低。雜合度和遺傳多樣性與群體對環境的適應能力正相關[18]。本研究中，瀾滄裂腹魚觀測雜合度和期望雜合度均是黃登—大華橋地理群體最大(0.5032、0.3322)苗尾—功果橋地理群體最小(0.1550、0.2133)。瀾滄裂腹魚4個地理群體的平均觀測雜合度和期望雜合度分別為0.3692、0.2909：與同一水系同屬的光唇裂腹魚(0.2695、0.2892)相比較[19]，雜合度較高；與同屬的短須裂腹魚(0.2007、0.3160)[20]相比較，觀測雜合度偏高，期望雜合度較低。這表明其對環境的適應能力可能稍弱。

根井正利基因多樣性指數是衡量群落豐富度的指標，該指數越高，群落越穩定；香農—維納多樣性指數是用來反應群體的多樣性程度的指數，指數越大，多樣性越高[21]。在本次研究中，瀾滄裂腹魚4個地理群體的平均根井正利基因多樣性指數和香農—維納多樣性指數分別為0.3137、0.4367，說明瀾滄裂腹魚的4個群體多樣性指數低，群體不是很穩定：與同水系同屬的光唇裂腹魚(0.3134、0.4628)[7]相比，平均根井正利基因多樣性指數偏高，香農—維納多樣性指數偏低；與同屬的短須裂腹魚(0.3386、0.4827)[20]相比，根井正利基因多樣性指數和香農—維納多樣性指數均較低，說明瀾滄裂腹魚群體多樣性偏低。4個地理群體中，黃登—大華橋根井正利基因多樣性指數和香農—維納多樣性指數最高(0.3430、0.4980)，苗尾—功果橋根井正利基因多樣性指數和香農—維納多樣性指數最低(0.2466、0.3187)，說明黃登—大華橋地理群體遺傳多樣性最高，苗尾—功果橋地理群體的遺傳多樣性最低。

3.2 變異位點分析

瀾滄裂腹魚4個地理群體的遺傳變異的分子生物學方差分析結果顯示，群體間的變異占2.91%，群體內的變異占97.09%。這表明遺傳分化主要發生在每個群體內部，群體間遺傳分化程度低，與遺傳分化指數分析結果相吻合。與同水系的光唇裂腹魚(群體間變異占89.73%，群體內變異占10.27%)相比[7]，群體內變異程度偏高，群體間的變異程度沒有光唇裂腹魚高；與用同一種標記方法分析的羅氏沼蝦(群體內變異占73.67%，群體間變異占26.33%)[21]相比較，瀾滄裂腹魚群體間變異程度低；與同屬的塔里木裂腹魚(群體內變異81.01%，群體間變異占16.68%)[22]相比較，瀾滄裂腹魚群體內變異程度稍高，但群體間的變異程度教低；與雅礱江長絲裂腹魚(S.dolichonema)群體(群體內變異占84.84%，群體間變異占15.16%)[23]相比較，瀾滄裂腹魚群體內變異程度高，群體間變異程度較低。這可能與所用測序方法不同有關系。

3.3 遺傳分化分析

研究表明：當0.05<遺傳距離<0.3時為同種不同群體；0.3<遺傳距離<0.9時為同屬不同種；遺傳距離>0.9為不同屬[21]。本研究中40個樣本的遺傳距離為0.0323～0.2588，說明研究對象為同種不同群體。根據評價標準：當0<遺傳分化指數<0.05時，表現為低等分化水平；當0.05<遺傳分化指數<0.15時，表現為中等分化水平；當遺傳分化指數>0.15時，表現為高等分化水平[17,24]。本研究中，群體間遺傳分化指數為-0.01496～0.12985：與同屬的墨脫裂腹魚(S.molesworthi)[25](遺傳分化指數-0.014～0.771)相比較，遺傳分化指數較低，可能與標記的方法不同有關；與用同一種標記方法的羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[26](遺傳分化指數0.045～0.363)相比較，遺傳分化指數較低。群體間分化指數均值為0.07629，分化程度處于中等水平。除苗尾—功果橋、烏弄龍、黃登—大華橋3個群體間分化處于低等水平外，其他群體間分化均處于中等水平。

聚類分析結果表明，黃登—大華橋地理群體聚成一支，里底地理群體聚為一支，苗尾—功果橋聚為一支，烏弄龍和其他地理群體有交叉聚類的現象，各地理群體的樣本有交叉聚類的現象。這可能是這些年來增殖放流引起的，因為黃登魚類增殖站負責大華橋、黃登、里底和烏弄龍幾個電站的魚類增殖放流任務，且在2012年黃登魚類增殖站運行之初，并未人工繁殖成功，放流所需魚苗是從下游功果橋增殖站調運的魚苗，以完成放流工作，從而引起不同地理群體交叉聚類。

3.4 瀾滄裂腹魚保護建議

遺傳多樣性是物種進化的基礎，豐富的遺傳多樣性在維持物種的種群數量和環境適應能力方面發揮很大的作用。魚類在河流生態系統中扮演著重要的角色，對于保持生態系統正常循環與能量流動起著重要作用[26]，水利工程開發和建設都會對魚類群體結構及遺傳多樣性分布造成不同程度的影響，進而影響生態系統的穩定性[27-28]。筆者對瀾滄裂腹魚的遺傳多樣性進行評估發現，其群體遺傳多樣性偏中下水平，群體內的變異程度遠遠高于群體間，梯級水電工程建設可能阻斷了群體間的遺傳交流，促進了這種遺傳分化現象的發展。建議瀾滄江中上游流域應當加大云南土著魚類資源監控力度，水電站因地制宜地修筑過壩設施，增強人工增殖放流的質量和力度。

4 結 論

研究結果顯示：在黃登—大華橋、里底、烏弄龍和苗尾—功果橋4個地理群體中，觀測等位基因數和期望等位基因數分別為1.90～1.97和1.36～1.57；觀測雜合度和期望雜合度的分別為0.16～0.50和0.21～0.33；根井正利基因多樣性指數和香農—維納多樣性指數分別為0.25～0.34和0.32～0.50；多態信息含量依次為0.2655、0.2499、0.2463、0.1709，處于中低等多態水平；最小等位基因頻率依次為0.2653、0.2579、0.2561、0.2724；所有遺傳多樣性指數中，以黃登—大華橋群體最高且呈差異顯著(P<0.05)；群體間的變異占2.91%，群體內的變異占97.09%，說明變異多發生在群體內，群體間的變異程度小；群體間遺傳距離為0.1946～0.6235，群體間的遺傳分化指數為-0.019～0.0817，4個地理群體出現交叉聚類的現象。