大神堂海域人工魚礁投放對底泥細菌的影響

王 宇，徐曉甫,2，于 瑩，郭 彪，高 燕，張 雪，張博倫，張晶偉

( 1.天津市水產研究所 漁業資源科，天津市海洋牧場技術工程中心，天津 300457；2.自然資源部海洋信息技術創新中心，國家海洋信息中心，天津 300171 )

渤海灣是中國最大的半封閉淺海，曾經是魚蝦蟹重要的產卵場和育幼場[1]。近年來，由于填海造陸、過度捕撈和環境污染等原因，渤海灣的環境和資源受到了極大的破壞[2-3]。為恢復海洋資源環境，天津市實施了一系列資源修復及環境治理措施，主要是增殖放流、伏季休漁和人工魚礁建設。2009年來，天津市根據海域特點，在漢沽大神堂海域進行了人工魚礁投放，截至2018年底，共投放鋼筋混凝土礁體29 308塊，形成礁區8.465 km2[4]。

人工魚礁造成海域水流、聲、光的變化從而引起一系列水化(如營養鹽、溶解氧、葉綠素等)和生物的變化(多樣性、生物量、食物網等)，經過一段時間可形成獨特的人工魚礁生態系統[5-6]，起到改善海洋環境和誘集海洋生物的作用，是修復海洋生態和增殖漁業資源的重要手段[7-9]。相關研究也表明，天津人工魚礁建設對資源增殖和環境修復起到了一定的作用，然而，關于人工魚礁的研究主要集中在水化、漁業資源等方面[10-12]，關于人工魚礁投放對微生物的影響和機理的研究尚未開展。細菌作為海洋生態系統重要的組成部分，發揮著能量流動、信息傳導和物質代謝的作用，是海洋生態系統中的生產者和消費者，對海洋環境的平衡和穩定起重要作用。而且，海洋微生物對環境的變化和人類的活動最為敏感，是環境狀態的指示者[13-14]。因此，人工魚礁區微生物的群落特征和影響因子分析是人工魚礁建設效果評估必不可少的重要內容之一。筆者開展天津大神堂海域人工魚礁區、對照區及新投礁區表層底泥細菌的種類、多樣性、功能基因及影響因子的相關研究，旨在為探明人工魚礁對海域的影響機理和效果的研究奠定基礎，為優化海洋牧場微生物群落結構和功能提供科學依據，為海洋牧場的科學建設指明方向。

1 材料與方法

1.1 采樣地點

天津大神堂海域國家級海洋牧場位于渤海灣西部，緊鄰天津大神堂國家級海洋特別保護區，受天津海岸大規模圍填海工程和過度捕撈的影響，牡蠣礁區生態系統壓力逐年增大，為保護牡蠣礁區的生物資源和環境，天津市于2009年開展了人工魚礁建設工作，截至2018年底已投放鋼筋混凝土礁體29 308塊，共計10.87萬m3，面積達8.465 km2，海域海水深度基本在10 m以內，形成淺堤型魚礁生態系統。由于2014年礁區與新投礁區位置較近且礁型一致，更具代表性和可比性，故對大神堂國家級海洋牧場的2014年人工魚礁投放區、2018年6月投礁區和對照區分別設置5個采樣地點，具體位置見圖1。于2018年9月中旬用采泥器對表層底泥進行無菌采樣，同時對底泥理化因子進行測量。

圖1 2018年9月人工魚礁區、新投礁區及對照區底泥細菌采樣站位Fig.1 Sampling site of sediment bacteria in artificial reef area,newly built reef area and control area in September 2018

每個站位用采泥器采集3 kg樣本，用15 mL無菌EP管收集3～5 g表層底泥(0～5 cm)用于16S rRNA基因分析，每個站位3個平行。用溫度計測量底泥溫度。剩余底泥樣本用于環境因子測定，所有樣品置于冷藏箱中保存后置于-80 ℃冷凍室保存待測。

1.2 環境因子檢測

環境因子均按照GB 17378.5—2007《海洋監測規范》中的方法測定[15]。底泥重金屬采用ICP-MS測定，硫化物用碘量法測定，總有機碳用重鉻酸鉀氧化—還原容量法測定，粒徑用粒徑分析儀測定，總磷用分光光度法測定，總氮用凱氏滴定法測定。

1.3 16S rRNA基因測序

使用CTAB法提取細菌總DNA，并使用NanoPhotometer分光光度計測定DNA濃度以及純度，然后將DNA溶于TE溶液中-80 ℃保存。

將上述方法提取的各樣本細菌總DNA，采用兩步PCR擴增方法進行文庫構建，將純化的DNA作為模板，擴增16S rRNA基因序列的V4～V5可變區，通用引物序列為515F(5′-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3′)和926R(5′-CCGTCAATTCMTT TGAGTTT-3′)。

第一次PCR反應體系：5×Buffer 10 μL，dNTP(10 mmol)1 μL，Phusion 超保真DNA聚合酶1 U，正、反向引物(10 mmol)各1 μL，模板DNA 20～50 ng，補充超純水至50 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，25個循環。第二次PCR反應體系：5×Buffer 8 μL，dNTP(10 mmol)1 μL，Phusion 超保真DNA聚合酶0.8 U，正、反向引物(10 mmol)各1 μL，模板DNA 5 μL，補充超純水至40 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，10 ℃保溫，8個循環。

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR結果進行檢測，檢測效果較好的樣本用體積分數2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，以回收產物為模板進行一次8循環的PCR擴增，將Illumina平臺測序所需要的接頭、測序引物、標簽序列添加到目的片段兩端。全部PCR產物采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)進行回收，并用FTC-3000TM Real-Time PCR儀進行熒光定量，均一化混勻后完成文庫構建，在Illumina MiSeq 2×300 bp平臺上完成測序。

1.4 生物信息學分析

測序得到的原始數據，存在一定比例的干擾數據，為使信息分析的結果更加準確、可靠，首先對原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據。

基于有效數據進行運算分類單元聚類和物種分類分析，根據運算分類單元聚類結果，一方面對每個運算分類單元的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對運算分類單元進行豐度、多樣性、韋恩圖和花瓣圖等分析[16-21]，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有運算分類單元信息等。另一方面，可以對運算分類單元進行多序列比對并構建系統發生樹，進一步得到不同樣品和分組的群落結構差異，通過主坐標分析、主成分分析、非度量多維尺度分析等降維圖和樣品聚類樹進行展示[22-24]。為進一步挖掘分組樣品間的群落結構差異，選用t檢驗、組間差異分析、線性判別分析、相似性分析和多重響應排列程序分析等統計分析方法對分組樣品的物種組成和群落結果進行差異顯著性檢驗[25-28]。同時，也可結合環境因素進行主成分分析、冗余分析和多樣性指數與環境因子的相關性分析，得到顯著影響組間群落變化的環境影響因子[29]。利用PICRUSt軟件基于Greengenes數據庫對每組最大豐度排名前10位的菌群進行功能注釋[30]。

2 結果與分析

2.1 運算分類單元分析

測序比對表明：調查海域9月表層底泥樣品共檢測到8736個運算分類單元，其中鑒定到種的細菌為360種；魚礁區底泥細菌聚類到8307個運算分類單元，新投礁區底泥樣品讀到8164個運算分類單元，對照區底泥讀到7405個運算分類單元，3個區域細菌平均運算分類單元為7959個。魚礁區運算分類單元個數>2018年新投礁區運算分類單元個數>對照區運算分類單元個數，魚礁區及新投礁區細菌相同運算分類單元為1044個，魚礁區及新投礁區細菌種類相似性更高(圖2)。

圖2 各區域細菌運算分類單元韋恩圖Fig.2 Venn plot of bacterial operational taxonomic unit (OTU) in each area

2.2 物種相對豐度

變形菌門是渤海灣中豐富最高的菌種，對照區變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門和芽單胞菌門豐度低于其他2個區域，只有厚壁菌門在對照區豐度高于其他2個區域。從屬上看，對照區細菌種類明顯多于其他2個區域，硫氧化菌(Sulfurovum)豐度顯著高于其他2個區域；魚礁區和新投礁區海洋伍斯菌(Woeseia)和脫硫細菌豐度顯著高于對照區。總體來說，對照區排名前10位的細菌種類豐度總和顯著高于其他2個區域(圖3、圖4)。

圖3 人工魚礁區、新投礁區、對照區細菌種類門水平相對豐度Fig.3 Relative abundance map of bacterial species (phylum level) in artificial reef area,newly built artificial reef area and control area

圖4 人工魚礁區、新投礁區、對照區細菌種類屬水平相對豐度Fig.4 Relative abundance map of bacterial species (genus level) in artificial reef area,newly built artificial reef area and control area

2.3 多樣性指數組間差異性分析

3個取樣區域底泥細菌物種平均數、香農多樣性指數及組間差異見圖5、表2、表3。

表2 3個區域的物種平均數及alpha多樣性指數Tab.2 Average number of species and alpha-diversity index in three sampling areas

表3 兩兩區域的P值Tab.3 P-value between every two areas

3個區域中，底泥細菌物種平均數及組內平均alpha多樣性指數(香農指數、辛普森指數、chao1指數、ACE指數)均為：魚礁區>2018年新投礁區>對照區，對照區與其他2個區域底泥細菌組內alpha多樣性指數具有顯著差異。2018年新投礁區各站位alpha多樣性指數范圍較大(圖5)，可能由于人工魚礁的投放改變了礁區的水文環境，對各站位底泥微生物影響較大，造成明顯的組間差異。魚礁區細菌豐度和種類較其他2個區域均較大。

圖5 人工魚礁區、新投礁區和對照區底泥細菌比對物種數和beta多樣性指數指數組間差異箱形圖Fig.5 Box plot of observed species and beta diversity index in three different groups in artificial reef area,newly built artificial reef area and control area

3個區域細菌群落beta多樣性指數的均值、最大值及最小值為：對照區>魚礁區>2018年新投礁區。這說明新投礁區各站位細菌群落結構差異更小。

2.4 非度量多維尺度分析

非度量多維尺度分析(圖6)顯示，魚礁區和新投礁區各站位樣品聚集在一起，對照區各站位樣品獨立聚集在一起。說明樣品組內相似性高，魚礁區和新投礁區樣品相似性高，與對照區差異明顯。

圖6 非度量多維尺度分析Fig.6 NMDS analysis diagram

2.5 組間差異物種分析

線性判別分析值(圖7)顯示，各區域的特異性細菌種類明顯不同，2018年新投礁區差異最顯著的細菌種類為厚壁菌門、芽孢桿菌、假單胞菌，魚礁區標志性細菌種類為δ-變形菌門、γ-變形菌門、脫硫桿菌目及海洋伍斯菌屬，對照區標志性細菌為彎曲菌目、交替單胞菌目、冷單胞菌科、硫氧化菌屬、發光桿菌屬、弧菌和科爾韋爾氏菌。

2.6 功能基因分析

原核分類群功能注釋適用于對環境樣本的生物地球化學循環過程(特別是碳、氫、氮、磷、硫等元素循環)進行功能注釋預測。

原核分類群功能注釋分析結果(圖8a)顯示，對照區底泥細菌群落化能異養及有氧化能異養的功能分組顯著高于其他2個區域，發酵功能基因稍高于其他2個區域，而硫酸鹽代謝相關功能基因較其他2個區域豐度低。可能是人工魚礁的投放加快了底泥中硫酸鹽的循環，增加了相關功能基因的豐度。

功能基因熱圖(圖8b)顯示，3個區域功能基因組成和特異種存在差異。2018年新投礁區主要為人類腸道、人類病原體和硝酸鹽代謝等基因。魚礁區為硫化物代謝功能基因、光能自養型基因，對照區主要為發酵、化能異養、有氧化能異養等基因。2018年新投礁區主要是桿菌，魚礁區主要是耗氧硫細菌，對照區主要是彎曲菌和弧菌等。

圖8 各區域功能基因組成及熱圖Fig.8 Functional gene composition map and heat map in each region

2.7 環境因子關聯分析

環境檢測表明，新投礁區粒徑較其他2個區域大，而硫化物、總磷、總氮含量相對其他2個區域小(表4)。典型相關分析表明，對3個區域影響最主要的因素為粒徑和硫化物，影響魚礁區細菌群落組成的環境因子主要為總磷，影響新投礁區細菌群落組成的環境因子主要為硫化物(圖9)。

表4 各區域沉積物環境因子數據Tab.4 Environment factors of sediment in each site

圖9 各站位細菌豐度與環境因子的關系Fig.9 Relationship between bacterial abundance and environmental factors in each site

3 討 論

細菌在海洋物質循環和能量流動中起到重要的作用，且對海洋環境的變化最為敏感，因此，沉積物細菌群落結構和功能的研究可作為人工魚礁建設效果評估的重要內容和指標之一。根據文獻記載，渤海灣春季和秋季表層底泥細菌豐度高于其他季節，且根據細菌的垂直分布特點，表層10 cm環境微生物豐度和多樣性最高，占海洋微生物總量的70%[31]，且相對海水，表層底泥對魚礁投放的響應更加敏感，因此，選擇秋季人工魚礁系統底泥作為研究對象[32]。

3.1 運算分類單元分析

測序注釋分析結果顯示，魚礁區細菌的種類數量最多，其次是新投礁區，可能由于魚礁的投放促進了礁區的物質循環和能量流動，形成了特定的環境，增多了細菌的種類。9月份沉積物細菌種類多于同一海域7月份(運算分類單元為4380個)，且較其他季節多，與文獻記載的渤海灣表層沉積物調查結果一致，也說明樣品具有代表性。

3.2 物種相對豐度

物種豐度結果顯示，渤海灣沉積物優勢菌群主要有變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和浮霉菌門，跟劉鵬遠等[33]研究一致。與對照區相比，新投礁區和魚礁區細菌豐度較高的細菌種類更為集中，可能是因為魚礁的投放造成了特定的環境改變了特定細菌的生長，造成了底泥細菌多樣性和群落結構的差異。

3.3 多樣性指數組間差異性分析

魚礁區的細菌多樣性高于新投礁區且顯著高于對照區，可能是魚礁投放改變了水域的環境，增加了礁區水體的流量，改變了礁區的物質循環和能量流動[7]，為細菌的生長提供了營養，從而影響了細菌的群落結構。新投礁區的beta多樣性指數最小，對照區最大，說明新投礁區各站位礁體間微生物群落趨于一致，魚礁投放對底泥微生物種類有很大的影響。

3.4 非度量多維尺度分析

聚類分析結果表明，投礁前，新投礁區細菌群落特征與對照區相似性更高[34]，投礁兩個月后，新投礁區細菌群落結構與已投礁區趨于一致，相同的運算分類單元數量也更多。可能是魚礁投放改變底質環境，隨著時間推移形成特定的功能微生物群落。

3.5 組間差異物種分析

魚礁區標志性細菌種類為δ-變形菌門、γ-變形菌門、脫硫桿菌目及海洋伍斯菌屬。其中γ-變形菌在水體沉積環境中分布廣泛，參與許多物質的代謝過程，如厭氧情況下氨、硫的代謝[35-36]。δ-變形菌主要作為在厭氧條件下還原硫酸鹽的硫酸鹽還原菌，參與硫酸鹽還原代謝，并且硫酸鹽還原菌是參與有機物礦化與污染物降解的重要物質[37]。魚礁區豐富的變形菌門分布可能暗示了此處含有豐富的硫化合物。新投礁區菌群主要為厚壁菌門和芽孢桿菌，均為好氧異養細菌，一般存在于有機質豐富的環境中。對照區差異物種彎曲菌為易引起人體腹瀉的有害細菌，弧菌則是海洋生物體表和腸道的優勢菌群，其中一些菌類也可能是致病菌。而對照區的科爾韋爾氏菌為嗜油菌，說明對照區環境有一定的污染。交替單胞菌是異養細菌，在物質代謝中起重要作用。新投礁區差異菌群為假單胞菌，主要為化能有機異養型細菌，有極強的有機物分解能力。而新投礁區差異菌群芽孢桿菌也屬于厚壁菌，具有快速降解有機物，減少氨氮、亞硝態氮和硫化氫等有害物質，起到優化環境的作用，為有益菌。

3.6 功能基因分析

環境因子檢測表明，新投礁區的硫化物含量最低，說明魚礁區底質環境良好[38]，可能跟硫酸鹽還原細菌含量高有一定關系。調查表明，人工魚礁的投放導致大量的牡蠣在此附著繁殖，產生了大量的有機物，加快了海域的沉積速率，提高了底泥中硫酸鹽的含量，可能使魚礁區硫酸鹽還原菌富集，通過呼吸作用消耗硫化物轉化為硫化氫，致使新投礁區及魚礁區的硫化物的含量比對照區低，也可能導致魚礁區溶解氧含量較低。新投礁區細菌功能基因則主要為人類腸道、人類病原體和硝酸鹽代謝基因，可能會導致該區硝酸鹽含量增加，這與底泥檢測結果對應。

3.7 環境因子關聯分析

典型相關分析表明，海域底泥細菌豐度主要受粒徑和硫化物影響。沉積物粒徑是沉積環境的基本參數，影響著細菌豐度和群落組成。人工魚礁投放為牡蠣的附著提供了場所，牡蠣的代謝會在礁區產生大量的細顆粒沉積物，細顆粒沉積物為細菌附著提供了更大的表面積和更多的有機質，為微生物的生長和繁殖提供更多的碳源[39]。研究結果表明，人工魚礁投放起到水質化學物質和微生物雙向調節的作用，與Sun等[40]的研究結果一致。本研究探明了人工魚礁對底泥細菌群落和功能的影響及相關機理，可為人工魚礁的效果評估及合理建設提供參考。