泥鰍鰓出血病病原菌及其拮抗菌的分離鑒定

王倩楠，馮 妍，賈凌晨，劉有華，皮喬木，徐思琪，李聯泰,，蔡月鳳，安賢惠,

( 1.江蘇海洋大學 海洋科學與水產學院，江蘇省海洋生物資源與生態環境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005 )

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)屬泥鰍科，為小型底棲淡水經濟魚類。泥鰍對生活環境有較強的適應性，一般生活在泥漿底部的靜止或緩慢流動的水體中，也可以生活在潮濕營養豐富的環境中，如湖底、池塘、溝渠和稻田底部。泥鰍主要分布在亞洲沿岸國家，如中國、日本、韓國和印度等；在我國廣泛分布于江西贛江支流、萍鄉等地的淡水流域[1]。泥鰍素有“水人參”[2]之稱，可直接加工食用也可干制入藥，因其富含蛋白質且肉質鮮嫩而備受人們喜愛，也是出口水產品之一[3]。

近年來，隨著市場需求的增加，泥鰍養殖業不斷發展，規模也不斷擴大，社會效益和經濟效益顯著提高，養殖出口量占泥鰍總產量的20%～40%，每667 m2可產泥鰍超過1000 kg，可獲純利潤至少5000元。然而，隨著養殖規模和密度不斷增大，其發病率也逐步升高，泥鰍病害大量發生甚至死亡，產量大幅度下降，造成極大的經濟損失。泥鰍病害主要為泥鰍出血病[4-5]、幼魚紅點病[6]、泥鰍腐皮病[7]等，致使其發病的病原菌主要有維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[8]、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)[5]等，其中維氏氣單胞菌感染所引起的病例占比較高，但從水產動物中分離得到其拮抗菌的報道較少[9-11]。

維氏氣單胞菌主要感染變溫動物[12]，對魚類具有較強的致病性，也是泥鰍鰓出血病的主要致病菌之一[13]，該細菌能通過傷口感染、水源和食源等途徑傳播[14]。在孟加拉國，該細菌曾引起魚類流行性潰瘍綜合征[15]。據報道，自養殖場的水生生物體內分離得到維氏氣單胞菌，通過檢測發現維氏氣單胞菌攜帶眾多致病因子，耐藥性也逐漸增強，對水產養殖業的正常健康發展具有潛在的威脅[16]。有研究表明，維氏氣單胞菌能感染草魚(Ctenopharyngodonidella)[17]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[18]、斑點叉尾(Ietaluruspunetaus)[19]、大刺鰍(Mastacembelusarmatus)[20]、泥鰍[21]等。秦蕾等[22]最早從泥鰍病灶部位篩選出1株維氏氣單胞菌NQ，該菌導致泥鰍出現體表出血、皮膚潰瘍等癥狀，其致死率達60%；王穎等[4]自泥鰍肝臟及病灶處篩選出2株維氏氣單胞菌Q2和Q3，均使泥鰍出現出血癥狀；盧艷敏等[5]自患病泥鰍中篩選出致使泥鰍出血的維氏氣單胞菌2株；徐先棟等[6]自泥鰍幼魚的肝臟、脾臟、腎臟及病灶部位篩出使其出現紅點病的維氏氣單胞菌FZ2N，其半致死劑量為1.1×103cfu/g。

拮抗菌的篩選已有報道。楊喬喬等[11]從泥鰍養殖場的水體中分離篩選得到泥鰍腐皮病的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)；郝彥利[23]篩選得到副溶血弧菌的拮抗菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis)H19；王侃[24]分離篩選得到1株海洋拮抗菌RF106。關于維氏氣單胞菌拮抗菌的篩選，國內報道較少。凡飛等[25]曾篩選獲得1株熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)4-1-3；何濤等[9]從草魚中分離得到的拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌。有研究表明，解淀粉芽孢桿菌拮抗物質為糖類物質[7]、脂肽類物質[9]、伊枯草菌素和芬薺素等[26]，熒光假單胞菌產生的拮抗物質包括黃綠膿菌素、吩嗪、氫氰酸、生物表面活性劑、鄰氨基苯甲酸等[27]。而有研究表明，屬于熒光假單胞菌生物變種Ⅱ的邊緣假單胞菌(P.marginalis)可致植物病變[28]，能夠降解煙堿[29]，但在水產養殖中未見有拮抗菌為邊緣假單胞菌的報道。筆者自出現鰓出血病癥狀的泥鰍病灶部位分離到泥鰍鰓出血病病原菌，并以此為指示菌對其拮抗菌進行分離與篩選，以期為該菌的生態防治研究提供參考，并為維氏氣單胞菌引發的病害防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鰓出血病泥鰍活體、健康泥鰍、水體及池塘底泥均采自江蘇省連云港某泥鰍養殖場。

1.2 主要試劑

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、dNTP、DNA Ladder Mix maker、Dream Taq-TM DNA Polymerase均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌的分離純化

隨機取鰓出血病泥鰍2尾，用體積分數75%的乙醇對樣品表面進行消毒，用解剖刀取其病灶部位，在無菌條件下劃線接種于LB固體培養基上，在28 ℃恒溫培養箱中培養，24 h后觀察菌落形態[30]。挑選不同形態、顏色、大小的單菌落進行多次分離純化，直至獲得純培養物。

1.3.2 回歸感染試驗

將分離出的純化物分別接種于LB液體培養基中，28 ℃培養24 h，將菌液分別稀釋至1.0×108cfu/mL[4]，試驗組泥鰍注射稀釋后的菌液0.1 mL/尾，對照組注射0.9%的無菌生理鹽水0.1 mL/尾[31]，每個菌株1組，每組3個平行，每個平行10尾。每隔24 h給泥鰍換水、投餌，每次換水1/3，觀察其生長狀況，并對感染泥鰍的生存情況、死亡率和死魚的癥狀進行觀察、記錄。

1.3.3 拮抗菌的分離

稱取泥鰍養殖場的底泥樣品5 g，放入盛有45 mL無菌水的三角燒瓶中，180 r/min振搖20 min，取1 mL放入盛有9 mL無菌水的試管中；取1 mL泥鰍養殖場的水體，放入盛有9 mL無菌水的試管中，分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋菌液，在無菌環境中將菌液涂布于LB固體培養基，每個密度3組平行，28 ℃恒溫培養，24 h后觀察菌落形態，挑選不同形態、顏色、大小的單菌落進行平板三區劃線，以達到分離純化的目的，重復挑單菌落劃線直至獲得純培養物。

1.3.4 拮抗菌的篩選——打孔抑菌圈法

利用打孔法[32]抑菌試驗篩選拮抗菌，以無菌LB液體培養基作對照組，其中一個孔里加入50 μL LB液體培養基，其他孔分別加入各個純化物的過夜發酵菌液50 μL，每組3個平行，置于28 ℃恒溫培養，10 h后開始每隔2 h觀察抑菌圈生長情況，直至長出抑菌圈，并測量抑菌圈大小。從初篩結果中選出有抑菌圈的菌株，通過重復打孔法進行復篩試驗。

1.3.5 病原菌和拮抗菌的形態觀察及生理生化鑒定

取適量菌液涂片，涂片后進行革蘭氏、芽孢和莢膜染色[33]。將拮抗菌以1∶100(體積比)的比例接種于LB液體培養基中，過夜振蕩發酵培養，利用微量生化鑒定管和自制的大分子水解培養基進行生理生化鑒定，并按照《常見細菌系統鑒定手冊》[33]操作。

1.3.6 16S rDNA序列的測定及系統進化樹的構建

提取篩選所得到的病原菌和拮抗菌總DNA，以細菌通用引物[21]1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)和27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)進行PCR擴增(表1)。

表1 PCR反應程序Tab.1 PCR reaction procedure

PCR擴增完成后，將產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。然后將目標菌的PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序完成后將所得序列提交至美國國家生物技術信息中心數據庫，應用BLAST程序與數據庫中已存在的細菌16S rDNA序列進行相似性的比較，運用MEGA 7.0構建系統發育樹。

1.3.7 拮抗菌藥敏試驗

將拮抗菌接種于LB液體培養基中，在振蕩培養箱中以180 r/min、28 ℃條件下恒溫培養24 h，測定其D(600 nm)，采用藥敏紙片法做抑菌試驗。將發酵好的菌液均勻涂布于LB固體培養基上，貼藥敏紙片：紅霉素、環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢克肟、慶大霉素、復方新諾明、利福平、阿莫西林、青霉素G、四環素、鏈霉素、磺胺異亞唑等，28 ℃恒溫培養24 h后測量抑菌圈直徑大小，以易華山等[34-35]提供的指標作為藥物敏感度標準。

1.3.8 拮抗菌抗菌譜

將本實驗室保存的病原菌鰻弧菌(Vibrianguillaris)、哈維氏弧菌(V.havieri)、創傷弧菌(V.vulnificus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)和豚鼠氣單胞菌(A.caviae)等接種于試管中活化，在28 ℃恒溫振蕩培養箱中以180 r/min過夜發酵。取不同的病原菌均勻涂布于LB固體培養基上，采用打孔法進行抑菌試驗，將發酵液加入孔中，28 ℃恒溫培養24 h后記錄抑菌圈直徑大小，每組3個平行。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離

按1.3.1中的方法，取不同的菌落進行觀察，經多次分離，得到7株不同形態的單菌落，分別編號為JY1、JY2、JY3、JY4、JY5、JY6和JY7。

2.2 回歸感染及病原菌的篩選

用上述獲得的7株病原菌，按1.3.2方法進行人工感染試驗，結果表明，菌株JY2、JY5、JY6對泥鰍均有不同程度的致病性，且有明顯的鰓出血癥狀(圖1)，其中感染菌株JY5的泥鰍在第2天全部死亡，即死亡率100%(表2)。

圖1 初選病原菌回歸感染健康泥鰍后的病癥Fig.1 Primary symptoms of healthy loach M. anguillicaudatus exposed to re-infected with primary selective bacterial pathogens

表2 菌株JY2、JY5、JY6對泥鰍的回歸感染試驗結果Tab.2 Regression infection test results of loach M. anguillicaudatus challenged with strains JY2,JY5 and JY6

2.3 拮抗菌的分離純化及篩選

經過分離純化后得到28株不同形態的單菌落，其中菌株CJT4、CJT6、CJT10、CJT17-2和CJT23共5個純化物表現出不同程度的抑菌活性。菌株CJT23的抑菌圈最大，因此確定菌株CJT23為目標拮抗菌，其抑菌效果見圖2。

圖2 CJT23抑制JY5效果Fig.2 Effect diagram of JY5 inhibited by CJT23

2.4 病原菌和拮抗菌的形態特征及生理生化鑒定

將菌株JY5和CJT23在LB固體培養基上培養，菌株JY5形態特征：菌落呈圓形，灰白色，不透明，中央稍凸起，表面光滑，邊緣整齊；革蘭氏陰性菌，短桿狀(圖3a～b)。菌株CJT23形態特征：菌落呈圓形，白色，半透明，中央凸起，邊緣整齊光滑，黏稠不易挑起；革蘭氏陰性菌，短桿狀，無芽孢，有莢膜，有運動性(圖3c～d)。

圖3 菌落形態及革蘭氏染色Fig.3 Colony morphology and Gram staininga、b.病原菌JY5；c、d.拮抗菌CJT23.a,b.pathogenic bacterium JY5；c,d.antagonistic bacterium CJT23.

病原菌JY5大分子水解培養基結果(圖4)表明：淀粉水解培養基中出現無色透明圈，說明淀粉已被水解，為陽性；油脂水解培養基中出現紅色斑點，說明脂肪已被水解，為陽性；明膠水解培養基呈液化狀態(對照組呈凝固狀態)，說明明膠被水解，為陽性。拮抗菌CJT23淀粉水解、油脂水解、明膠水解結果分別呈現出無色透明圈、紅色斑點、明膠液態化，說明淀粉、脂肪、明膠均被水解，為陽性(圖4)。

圖4 病原菌JY5和拮抗菌CJT23對大分子物質水解反應Fig.4 Hydrolysis of macromolecules by pathogenic bacterium JY5 and antagonistic bacterium CJT23A.病原菌JY5；B.拮抗菌CJT23；a.淀粉水解；b.油脂水解；c.明膠水解；1.對照組；2.試驗組.A.pathogenic bacterium JY5；B.antagonistic bacterium CJT23；a.starch hydrolysis；b.oil hydrolysis；c.gelatin hydrolysis；1.control group；2.experimental group.

病原菌JY5和拮抗菌CJT23的生理生化鑒定結果見表3、表4。病原菌JY5能夠利用葡萄糖、甘露醇、果糖肉湯等，而不能利用赤蘚醇、乳糖、苯丙氨酸等。拮抗菌CJT23能利用葡萄糖、七葉苷、西蒙氏枸櫞酸鹽、賴氨酸脫羧酶等，不能利用木糖、酒石酸鹽、阿拉伯醇、硝酸鹽等。

表3 病原菌JY5的生理生化特性Tab.3 The physiological and biochemical characteristics of the pathogenic bacterium JY5

表4 菌株CJT23的生理生化特性Tab.4 The physiological and biochemical characteristics of the antagonistic bacterium CJT23

2.5 病原菌和拮抗菌16S rDNA序列測定及系統發育樹構建

按1.3.6方法，將病原菌JY5和拮抗菌CJT23測序所得序列提交至GenBank數據庫進行BLAST比對，結果顯示，病原菌JY5與維氏氣單胞菌同源性達到100%，拮抗菌CJT23與邊緣假單胞菌同源性達到99%。由MEGA 7.0構建的系統發育樹見圖5、圖6。病原菌JY5與維氏氣單胞菌聚為一支，同時根據其菌落形態及生理生化特性，將該菌暫定名為維氏氣單胞菌JY5(GeneBank登錄號MW418195)；拮抗菌CJT23與邊緣假單胞菌聚為一支，且菌落形態及生理生化特性與其相似，因此，將CJT23初步命名為邊緣假單胞菌CJT23(GeneBank登錄號MW418194)。

圖5 基于16S rDNA序列BLAST結果構建的細菌JY5的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of bacterial JY5 based on 16s rDNA sequence BLAST

圖6 基于16S rDNA序列BLAST結果構建的細菌CJT23的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of bacterial CJT23 based on 16s rDNA sequence BLAST

2.6 拮抗菌藥敏性

藥敏試驗結果表明，邊緣假單胞菌CJT23對環丙沙星、諾氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、恩諾沙星、復方新諾明敏感性較強(表5)，用邊緣假單胞菌CJT23防治維氏氣單胞菌時應避免使用以上敏感藥物和中敏藥物。

表5 菌株CJT23的藥敏性Tab.5 Drug sensitivity of bacterium CJT23

2.7 拮抗菌的抗菌譜

拮抗譜結果表明，邊緣假單胞菌CJT23對不同的病原菌表現出不同的拮抗作用，其中：對維氏氣單胞菌JY5的抑菌性最強，抑菌圈直徑最大達(21.00±0.41) mm；對副溶血弧菌和鰻弧菌拮抗性較強，抑菌圈直徑分別為(17.97±0.21)、(15.93±0.26) mm；創傷弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、哈維氏弧菌抑菌圈直徑分別為(12.73±0.26)、(12.63±0.17)、(12.57±0.12)、(11.47±0.17) mm；對豚鼠氣單胞菌無抑菌效果(圖7)。故菌株CJT23對防治由維氏氣單胞菌、副溶血弧菌、鰻弧菌引起的病害可能會有更好的效果。

圖7 拮抗菌的抗菌譜Fig.7 Antimicrobial spectrum of antagonistic bacteriuma.維氏氣單胞菌JY5；b.副溶血弧菌；c.鰻弧菌；d.創傷弧菌；e.哈維氏弧菌；f.嗜水氣單胞菌；g.溫和氣單胞菌；h.豚鼠氣單胞菌；A.無菌LB液體培養基；B.發酵液.a.A. sveronii JY5；b.V. parahaemolyticus；c.V. anguillaris；d.V. vulnificus；e.V. havieri；f.A. hydrophila；g.A. sobria；h.A. caviae；A.sterile LB liquid medium；B.the fermented liquid.

3 討 論

3.1 深入研究需增加管家基因序列測序

本試驗中，因基于生產實踐，以快速得到大致結果服務于生產，故只從菌種形態觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析方面進行了初步鑒定。如果要在理論上進一步深入研究本試驗涉及的2個菌株，則需要增加管家基因，如gyrB、cpn60、dnaJ等基因。

3.2 試驗用病原菌維氏氣單胞菌源于生產實踐

維氏氣單胞菌對魚類具有較強的致病性，有研究表明，維氏氣單胞菌能感染泥鰍[21]。筆者根據連云港某泥鰍養殖場泥鰍養殖過程中發生的鰓出血病，有針對性地分離得到1株致病性較強的菌株JY5，從形態特征、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析等，初步判斷該菌株為維氏氣單胞菌，其結果與王穎等[4-6,22]的結果基本一致。有學者從泥鰍病灶部位篩選出維氏氣單胞菌，魚體有體表出血癥狀[4-5,22]，但鰓出血癥狀未見報道。同時關于該病原菌的致病機理、致病途徑等諸多方面的深化研究均有待進一步開展。

3.3 維氏氣單胞菌拮抗菌篩選可為生物防治提供參考

近年來，篩選拮抗菌防治水產養殖病害的研究越來越多，拮抗菌作為生物防治的一種有效且環保的防治方法，目前被廣泛應用。本試驗中，有針對性地篩選維氏氣單胞菌JY5的拮抗菌，獲得具有較強拮抗作用的菌株CJT23。從形態特征、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析等方面，初步判斷該菌株為邊緣假單胞菌，結果與甘琴華等[28]結果基本一致。關于水產動物拮抗菌的篩選已有報道，已篩選出的菌株有解淀粉芽孢桿菌[9,11]、枯草芽孢桿菌[23]、熒光假單胞菌[25]等，但邊緣假單胞菌在水產養殖中作為拮抗菌且其活性物質的研究尚未見報道。這一試驗結果擴充了維氏氣單胞菌拮抗菌的類型，豐富了維氏氣單胞菌拮抗菌資源庫，為維氏氣單胞菌引發的病害防治奠定了材料基礎。筆者后續工作將分離純化并鑒定邊緣假單胞菌CJT23的活性物質，為揭示其拮抗機理以進一步開發利用奠定基礎。

3.4 拮抗菌的研發使用為泥鰍養殖業發展和環境保護提供基礎

在水產養殖中，傳統防治病害的方法是使用化學藥品和抗生素[22]。由于化學藥品和抗生素的濫用，出現了諸多弊病。如藥物殘留，間接危害人體健康[36]，破壞機體內微環境，破壞水環境的微生態平衡，使養殖水產品和病原菌產生耐藥性并污染環境[37]。筆者主要對拮抗菌進行藥敏試驗，旨在在水產養殖中利用邊緣假單胞菌抑制維氏氣單胞菌時避免使用對邊緣假單胞菌呈現敏感及中敏的藥物。根據目前查閱的資料，國內外對維氏氣單胞菌疫苗研究的報道較少[19,38]，因此，研發新型微生物制劑或疫苗引起了科研工作者的關注，成為生物防治的研究熱點[39]。通過生物防治的途徑，可有效減少水產養殖業中水生動物病害的發生，能夠有針對性地解決魚類疾病，減少水產養殖過程中魚類的發病率，降低水產養殖業的損失，同時避免水產養殖中使用抗生素而造成環境污染及藥物殘留，為水產養殖的可持續性發展和環境保護提供基礎資源。

4 結 論

連云港某泥鰍養殖場的泥鰍出現鰓出血病是因為感染了維氏氣單胞菌JY5，以維氏氣單胞菌為指示菌分離篩選得到其拮抗菌邊緣假單胞菌CJT23。邊緣假單胞菌CJT23菌落呈圓形，白色，半透明，中央凸起，邊緣整齊光滑，黏稠不易挑起；屬革蘭氏陰性菌，短桿狀，無芽孢，有莢膜，有運動性。邊緣假單胞菌CJT23淀粉水解、油脂水解、明膠水解均為陽性。邊緣假單胞菌CJT23對環丙沙星、諾氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、恩諾沙星、復方新諾明敏感性較強。邊緣假單胞菌CJT23對維氏氣單胞菌JY5抑菌性最強，抑菌圈直徑最大達到(21.00±0.41) mm；對副溶血弧菌和鰻弧菌拮抗性較強，抑菌圈直徑分別為(17.97±0.21)、(15.93±0.26) mm。