ITP患兒免疫球蛋白、淋巴細胞亞群及Th17/Treg的表達分析

黃寶山，徐佳麗，姜 帥，李 蓉，張林美，李 莉

(1.江蘇省徐州市兒童醫院 221000；2.徐州醫科大學附屬醫院，江蘇徐州 221000)

免疫性血小板減少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura，ITP)主要為血小板減少引起，發病機制涉及血管因素、脾臟因素、免疫因素及遺傳因素，患病后可表現為皮膚、黏膜出血，嚴重者可引起內臟出血及顱內出血，危急生命安全[1-2]。近幾年的研究顯示，免疫功能失調及相關細胞因子的紊亂可能參與ITP發生過程[3]。其中有報道顯示，巨噬細胞對血小板相關免疫球蛋白(platelet-associated immunoglobulin,PAIg)造成的吞噬、破壞是ITP發病的主要機制[4]。另有研究指出，T淋巴細胞異常分化而造成的細胞免疫調節機制異常亦為ITP的發病機制，其包括輔助性T細胞(helper T cells，Th)的失衡及調節性T細胞(regulatory T cells,Treg)的異常降低[5]。但目前臨床對于PAIg、淋巴細胞亞群及Th17/Treg失衡與ITP的發生及機制的研究較少?；诖?，本研究探討ITP患兒PAIg、淋巴細胞亞群及Th17/Treg失衡情況，并分析其臨床價值，以期為ITP的臨床防治提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年9月至2021年9月徐州市兒童醫院收治的92例ITP患兒作為病例組。納入標準：(1)符合ITP診斷標準；(2)初次發?。?3)入組前均未經治療；(4)臨床資料完整者。排除標準：(1)重要臟器功能不全者；(2)繼發性血小板減少癥；(3)血液疾病史者；(4)自身免疫性疾病患者。病例組中男42例，女50例，年齡4～13歲，平均(8.2±2.1)歲。另根據患兒性別、年齡為配伍原則，選取同期84例健康體檢兒童為對照組，其中男36例，女48例，年齡3～13歲，平均(8.1±2.2)歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

患兒入院后抽取肘靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，3 000 r/min離心，并將血清進行分離，取上清液于-80 ℃保存。(1)PAIg：PAIgG、PAIgA、PAIgM采用羅氏COBAS8000全自動生化免疫儀檢測(試劑盒購自北京中山生物技術有限公司)。(2)淋巴細胞亞群：CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56細胞采用流式細胞儀(EPICS ELITE型，美國BD公司)檢測，各淋巴細胞亞群的比例均采用SIMUL SET分析，其中CD3細胞為總T細胞，CD19細胞為總B細胞，CD4為Th，CD8為Treg，CD16和CD56為自然殺傷(natural killer，NK)細胞。(3)Th17/Treg：Th17及Treg比例采用流式細胞儀檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組PAIg水平比較

病例組PAIgG、PAIgA、PAIgM水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組PAIg水平比較

2.2 兩組淋巴細胞亞群水平比較

病例組CD3、CD4、CD4/CD8、CD16+CD56水平低于對照組，CD8、CD19水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組淋巴細胞亞群水平比較

2.3 兩組Th17/Treg水平比較

病例組Th17、Treg及Th17/Treg水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組Th17/Treg水平比較

2.4 相關性分析

Pearson相關性顯示，PAIgG、PAIgA、PAIgM、CD8、CD19與Th17、Treg均呈負相關，CD3、CD4、CD4/CD8、CD16+CD56與Th17、Treg、Th17/Treg均呈正相關(P<0.05)，見表4。

2.5 PAIg、淋巴細胞亞群及Th17/Treg對ITP的診斷價值

ROC曲線顯示，PAIgG、PAIgA、PAIgM、CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、CD19、CD16+CD56、Th17、Treg及Th17/Treg診斷ITP具有一定準確性(AUC>0.7)，見表5、圖1～2。

圖1 PAIg及淋巴細胞亞群對ITP診斷的ROC曲線

表4 相關性分析

表5 PAIg、淋巴細胞亞群及Th17/Treg對ITP的診斷價值

圖2 淋巴細胞亞群及Th17/Treg對ITP診斷的ROC曲線

3 討 論

ITP為臨床常見的血小板減少性疾病，其發生率占出血性疾病的30%左右，并以外周血血小板數量減少、皮膚黏膜及內臟出血和血小板膜糖蛋白特異性自身抗體的出現為主要臨床表現[6-7]。臨床研究指出，ITP血小板的破壞需以血小板、抗體及巨噬細胞存在為基礎，同時具備充分的時間使機體對抗原接觸、致敏，產生抗體并結合，促使巨噬細胞對抗體結合的血小板進行吞噬[8-9]。且目前研究顯示，自身抗體致敏的血小板被體內巨噬細胞大量吞噬、破壞是ITP的主要發病機制，因此，在ITP患者的血小板表面可檢測到PAIgG、PAIgA、PAIgM等相關抗體[10-11]。另有研究證實，與健康者相比，ITP患者血清中PAIg水平異常升高，故有效檢測ITP患者血清中PAIg水平對ITP的診斷具有一定的價值[12]。本研究病例組PAIgG、PAIgA、PAIgM水平均高于對照組，且ROC曲線顯示PAIgG、PAIgA、PAIgM診斷ITP的AUC、靈敏度及特異度均較高，該結果與高婧等[13]研究結論具有一致性，提示ITP發病機制中體液免疫具有重要作用。

T淋巴細胞在免疫反應中可作為細胞及體液免疫反應的重要環節，其可在抗原刺激下活化，產生大量的淋巴因子，在機體免疫中具有調節作用[14]。正常情況下，T淋巴細胞亞群之間的正常比例及功能形成是免疫應答的基礎，CD4、CD8細胞間相互制約及相互誘導形成的T細胞網絡是維持機體免疫內環境穩定的重要環節，而其平衡異常是免疫介導性疾病損傷的重要因素[15]。本研究中，與健康人群相比，ITP患兒外周血的CD3、CD4、CD4/CD8、CD16+CD56水平均降低，而CD8、CD19水平均升高。其原因可能為：ITP患兒CD4水平下降主要為誘導細胞的數目降低、功能減弱，而CD8增加后可降低誘導細胞對T抑制細胞的誘導作用，造成T抑制細胞功能減弱，因此，無法充分抑制B細胞，使B細胞功能亢進，所以CD19水平升高[16]。另ROC結果顯示，CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、CD19、CD16+CD56診斷ITP的AUC分別為0.851、0.772、0.846、0.949、0.956、0.750，均具有一定準確性。以上結果提示，除體液免疫機制外，淋巴細胞亦可能參與ITP的發生、發展過程。

Treg為CD4+T細胞的新亞群，具有維持機體免疫平衡作用。研究顯示，Treg不僅可對機體過度免疫造成的損傷產生抑制作用，且可對宿主的免疫性保護作用進行抑制，影響機體對病原體的清除[17]。且已有研究指出，Treg可分泌大量白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10及轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)等細胞因子，進一步參與機體炎性反應及免疫應答[18]。近年來的研究顯示，ITP患兒外周血中Treg水平異常，其數量的減少可減弱T淋巴細胞活化增殖，進一步對機體免疫耐受產生破壞，造成機體免疫平衡狀態失衡[19]。分析其原因為：CD4+T細胞數量的減少使機體中參與免疫抑制作用的細胞隨之減少，破壞了機體免疫耐受平衡，降低了機體免疫抑制功能，進一步激活了自身反應性T細胞；同時，機體免疫平衡破壞后，B細胞的活化及增殖可促使機體產生相應的抗體，以上均可造成體液免疫及細胞免疫異常，進而破壞血小板。這與ITP發生、發展過程相符，故Treg的減少可能參與ITP發生、發展。而Th17亦為CD4+T細胞亞群的一種，其主要分泌IL-17、IL-21、IL-22等炎性因子，分泌的大量炎性細胞因子促進中性粒細胞的活化及聚集，介導炎癥級聯反應放大，因此，可參與感染性疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等疾病的發生、發展。本研究中，病例組Th17水平低于對照組，且ROC曲線顯示，Th17對ITP具有一定的診斷價值?？紤]為Th17細胞可分泌大量的IL-17分子，誘導其他細胞因子產生，導致ITP患兒機體中免疫調節功能異常，影響疾病的發生、發展。另Treg及Th17均源自共同的細胞分化前體，正常情況下二者相互拮抗，可維持機體免疫平衡穩定。本研究中病例組Th17/Treg水平低于對照組，相關性分析顯示PAIgG、PAIgA、PAIgM、CD8、CD19與Th17、Treg均呈負相關，CD3、CD4、CD4/CD8、CD16+CD56與Th17、Treg、Th17/Treg均呈正相關(P<0.05)，提示Th17/Treg失衡可能在ITP的發生、發展中具有一定的作用。

綜上所述，ITP作為自身免疫性疾病，其發生、發展不僅與體液免疫異常有關，還與細胞免疫異常有關，同時Th17/Treg相互制約的關系可維持機體免疫平衡。