EphB4抑制早產大鼠視網膜病變新生血管的實驗研究

李 游，陳曉隆，張玉強

(1.愛爾眼科醫院集團錦州愛爾眼科醫院，遼寧錦州 121001；2.中國醫科大學附屬盛京醫院眼科，沈陽 110004；3.錦州醫科大學骨科研究所，遼寧錦州 121001)

在早產兒視網膜病變的患者中，視網膜新生血管大量增殖可導致出血，牽拉視網膜可導致裂孔及脫離，嚴重者可永久致盲[1]，由此帶來的各種問題越來越引起人們的重視。目前已知與早產兒視網膜病變的視網膜新生血管形成有關的因素有很多，但新生血管的增殖機制非常復雜[1-2]，仍有許多未知因素無確切結論。因此，本課題組從基因角度入手，進一步研究早產兒視網膜病變的治療方案。RTK信號通路是生成新生血管的機制之一[3]，其中促紅細胞生成肝細胞激酶(Eph)/促紅細胞生成肝細胞激酶受體相互作用蛋白(Ephrin)系統傳遞血管內皮生長因子(VEGF)/血管內皮細胞生長因子受體(VEGFR)和內皮細胞TEK酪氨酸激酶(Tie)定位信號，其在血管形成中影響血管內皮細胞的增殖，控制新生血管發展[4]，EphB4/EphrinB2在視網膜新生血管的形成和增殖中起到了重要的作用。因此，本課題組擬建立SD大鼠氧誘導視網膜病變模型來模擬人類早產兒視網膜病變，研究視網膜新生血管增殖過程中EphB4/EphrinB2表達的變化，觀察玻璃體腔內注射EphB4能否抑制或減少視網膜新生血管的生成，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

20只健康SD孕鼠購于錦州醫科大學實驗動物中心，待新生幼鼠7 d齡時進行建模和實驗。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠視網膜病變模型的建立

80只7 d齡SD大鼠分為4組：模型組、干預組和對照組和正常組，每組20只。將模型組置于氧濃度75%的密閉艙內5 d后回到正常室內環境中，建立視網膜病變模型[2]；干預組建立視網膜病變模型并于出倉后(12 d)玻璃體腔注射EphB4 1 μL(美國VasGene Therapeutics公司)；對照組幼鼠同樣建立視網膜病變模型，于12 d玻璃體腔注射生理鹽水1 μL；正常組置于正常空氣中常規飼養。各組分別于17 d處死并取材。

1.2.2組織的制備

腹腔注射3 g/kg水合氯醛處死大鼠，取雙眼。將右眼一部分制作成視網膜鋪片進行ADP酶染色，另一部分做冰凍切片進行EphB4/Ephrin免疫熒光檢測。左眼視網膜組織集中冷凍保存，用于實時熒光定量PCR檢測EphB4 mRNA。

1.2.3視網膜鋪片的制作及ADP酶染色

摘取的SD幼鼠眼球在4%多聚甲醛中充分固定，手術顯微鏡下仔細分離出視網膜和脈絡膜，用0.05 mol/L馬來酸緩沖液沖洗，在37 ℃的ADP培養液中培養15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底清洗，10%硫酸銨著色，甘油明膠密封，顯微鏡下觀察視網膜血管的形態和分布[2]。

1.2.4EphB4/EphrinB2蛋白的免疫熒光雙標檢測

制作視網膜冰凍切片。山羊血清封閉后加入一抗EphB4及EphrinB2多克隆抗體，4 ℃冷藏過夜后加入Cy3和熒光素鈉標記的二抗IgG，暗盒內室溫靜置90 min，加入DAPI暗盒內室溫靜置5 min，充分洗滌，甘油明膠密封，遮光，激光共聚焦顯微鏡下觀察EphB4/EphrinB2蛋白在視網膜的分布和表達情況[2]。

1.2.5EphB4 mRNA的實時熒光定量PCR檢測

根據EphB4和內參β-actin的mRNA序列合成所需引物。先提取出視網膜組織中EphB4和內參β-actin的總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA的第一鏈，進行PCR擴增反應，繪制溶解曲線[1]。計算各組EphB4 mRNA的相對表達水平，進行統計[2]。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 視網膜新生血管的觀察

新生血管呈毛刷狀或團簇狀，而正常血管呈樹枝狀走形，二者有明顯不同的形態。模型組和對照組視網膜血管迂曲擴張，可見大量的新生血管分布及眼底片狀出血；干預組視網膜血管樹枝狀走向，形態良好，有少量新生血管；正常組血管發育良好，見圖1。

A：模型組；B：對照組；C：干預組；D：正常組。

2.2 視網膜中EphB4和EphrinB2蛋白的表達

激光共聚焦顯微鏡下可以清晰地觀察到視網膜各層的組織形態，EphB4和EphrinB2大量表達于視網膜新生血管生成區，且圖像重合后發現EphB4的紅色熒光與EphrinB2的綠色熒光聚集在視網膜新生血管生成區互相重合呈黃色。細胞核染色為藍色熒光。正常組少量表達EphB4和EphrinB2，模型組和對照組大量表達EphB4和EphrinB2，干預組EphB4和EphrinB2的熒光染色亮度明顯弱于模型組和對照組，見圖2。

圖2 SD大鼠視網膜EphB4/EphrinB2蛋白的免疫熒光雙標染色(200×)

2.3 大鼠視網膜實時熒光定量PCR結果

EphB4 mRNA在模型組視網膜的相對表達水平為0.87±0.11，而正常組為0.19±0.03，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。EphB4 mRNA在干預組視網膜的相對表達水平為0.25±0.04，明顯低于模型組及對照組(0.96±0.13)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

A：擴增曲線；B：溶解曲線。

3 討 論

早產兒視網膜病變是一個非常復雜的病理過程。視網膜的新生血管沒有發育完全，容易破裂出血和機化，形成機化膜后會牽拉視網膜發生裂孔，造成視網膜脫離，手術很難完全恢復視力。視網膜要形成新的血管，EphrinB配體及其同源Eph受體是最重要的導向分子之一，在信號傳輸中起著重要作用[6]。EphrinB2配體及其受體EphB4已被證明在動脈和靜脈內皮細胞中均有特異表達，傳遞血管內皮細胞之間的雙向信號，并控制胚胎中的心血管內皮細胞的生長和連接[7]。內皮特異性EphrinB2缺失導致血管形態發生缺陷。相反，功能性EphrinB2表達已被證明在出生后新生血管形成中促進動脈和靜脈血管之間的相互作用[8]。在血管重塑過程中，EphrinB2的表達增強了血管修剪和周細胞對內皮組裝的影響[9]，參與了視網膜血管的形成。

有研究表明，玻璃體腔注射可溶性EphB4-Fc、EphrinB2或可溶性EphB4能抑制大鼠視網膜血管的形成[10]。同時，EphB4和EphrinB2也存在于在動脈和靜脈血管叢，以及血管網的深層[11]，EphB4在大鼠視網膜新生血管中的作用主要表現為視網膜淺靜脈的血管生成及連接，在視網膜血管發育過程中也大量存在[9]。研究結果表明，EphB2-Fc激活EphrinB2可明顯增強血管生成[12]。在小鼠胚胎細胞中敲除EphrinB2結合的PDZ區后發現，視網膜血管內皮細胞形成絲狀偽足的能力明顯降低，相互連接不緊密，易形成發育不完全的新生血管[13-14]。用EphrinB2抗體治療后，血管內皮細胞骨架的動態變化達到平衡，血管形態多態性下降，更趨于環狀，表明EphB4/EphrinB2是影響血管內皮細胞功能的重要因素之一，是治療視網膜新生血管的有效靶點[15]。

綜上所述，Eph/Ephrin RTK系統的復雜性、多方面性和普遍性正應用于各種復雜的分子、細胞研究。這是一個新的和快速增長的研究領域，因為它們影響一系列細胞行為和生物過程，因此，在治療人類疾病方面具有巨大的潛力。Eph/Ephrin信號通路可以作為調節血管新生的靶點抑制視網膜新生血管的形成，本研究通過注射EphB4調節視網膜病變中視網膜EphB4/EphrinB2的活性，觀察了EphrinB2表達的改變及對新生血管生成的影響，為治療視網膜新生血管提供新的理論依據和治療策略。