連翹酯苷A通過TLR4/NF-κB p65/NLRP3軸對宮內感染所致新生大鼠肺損傷及免疫功能的影響研究

王 云，趙亞麗，郎明瑤，尹紅亞

(1.河北省保定市第二醫院兒科 071000；2.河北省保定市第二中心醫院兒科 072750；3.河北省兒童醫院婦產科，石家莊 050031)

宮內感染主要是由于病原微生物侵入羊膜腔導致胎盤、胎膜發生炎性反應引起，炎性因子的“瀑布式”級聯反應常引發新生兒肺功能損傷，與胎兒發生支氣管肺發育不良密切相關。連翹酯苷A可抑制感染H9N2禽流感病毒小鼠的炎性反應[1]。此外，連翹酯苷A可增強氧自由基清除力和免疫功能，抑制潰瘍性結腸炎大鼠炎性反應[2]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65信號通路激活可促進炎性因子釋放。研究發現，芪藶強心膠囊可抑制該信號通路，減輕心力衰竭大鼠心肌組織炎性反應[3]。本研究通過建立宮內感染所致新生大鼠肺損傷模型，連翹酯苷A灌胃治療，探討連翹酯苷A對肺損傷和免疫功能的影響，以及對TLR4/NF-κB p65/NOD樣受體3(NOD-like receptor 3，NLRP3)信號通路的調節作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

健康清潔級雌性SD大鼠50只，8周齡，體重180～200 g；雄性SD大鼠25只，8周齡，體重190～210 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2018-0001。

1.1.2試劑與儀器

連翹酯苷A(純度>98%)購自北京國家藥品和生物制品控制研究所；脂多糖購自美國Sigma公司；大腸桿菌購自中國獸醫藥品檢察所；白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8和IL-1β ELISA試劑盒購自美國R&D公司；兔抗鼠TLR4、NF-κB p65、p-p65、NLRP3及GAPDH抗體購自美國Abcam公司；CD4+和CD8+單克隆抗體購自北京同立海源生物科技有限公司；酶標儀購自美國Bioteck公司；小動物呼吸功能分析系統(AniRes2005)購自北京貝蘭博科技公司。

1.2 方法

1.2.1模型制備[4]

下午4:00后，雌雄大鼠2∶1比例合籠，次日上午用棉簽擦拭雌鼠陰道，對其分泌物做涂片檢查，顯微鏡下觀察，以精子布滿視野記為妊娠第0天。取40只雌鼠在孕第15天，陰道擴張器暴露孕鼠子宮頸，6號注射器將0.2 mL大腸桿菌稀釋液注射入子宮頸肌肉內，兩側宮頸均進行注射。造模第2天起，將40只孕鼠分為模型組、連翹酯苷A組、脂多糖組和脂多糖+連翹酯苷A組，每組10只，連翹酯苷A組和脂多糖+連翹酯苷A組孕鼠灌胃連翹酯苷A 50 mg/kg，每天1次，脂多糖組和脂多糖+連翹酯苷A組孕鼠尾靜脈注射脂多糖 5 mg/kg，每天1次，直至自然分娩，各組新生大鼠選取10只用于實驗。

1.2.2宮內感染判斷標準

孕鼠分娩后，留取胎盤組織，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈后，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察，若出現血管水腫、充血，中性粒細胞增多則說明發生宮內感染。

1.2.3新生大鼠呼吸頻率測定

記錄孕鼠分娩情況，7 d后記錄新生大鼠存活情況。于出生后第8天將新生大鼠麻醉，切開氣管后進行插管，通過導管連接呼吸機和信號調理器，使用肺功能檢測軟件記錄新生大鼠呼吸頻率。

1.2.4ELISA檢測新生大鼠血清中IL-8、IL-6和IL-1β濃度

呼吸頻率記錄完成后，斷頭處死，收集3 mL主動脈血，離心，吸取上清液。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，酶標儀上測定波長490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5流式細胞儀檢測血清中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+淋巴細胞數量

呼吸頻率記錄完成后，取3 mL新生大鼠主動脈血于流式管中，嚴格按照試劑盒說明書操作，流式細胞儀分析CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值。

1.2.6HE染色觀察新生大鼠肺組織病理損傷

采血結束后，迅速取出右側肺組織，進行HE染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每張切片選取5個視野。

1.2.7Western blot檢測肺組織TLR4、p-p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白相對表達水平

左側肺組織液氮中研磨，裂解，離心，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度，煮沸。上樣、電泳、濕轉、洗膜、封閉，TLR4、p-p65、NF-κB p65、NLRP3、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗孵育1 h，洗膜，ECL發光液顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 胎盤組織HE染色

模型組和脂多糖組孕鼠胎盤組織輪廓不清晰，大量炎性細胞浸潤；連翹酯苷A組孕鼠胎盤輪廓尚清晰，少量中性粒細胞浸潤；脂多糖+連翹酯苷A組孕鼠胎盤組織病理情況較脂多糖組減輕，較連翹酯苷A組加重，見圖1。

2.2 孕鼠分娩情況及新生大鼠存活情況

孕鼠分娩情況：模型組、脂多糖組和脂多糖+連翹酯苷A組孕鼠出現早產，均在孕第18～20天分娩，對照組和連翹酯苷A組孕鼠在孕第22～23天分娩，孕鼠無死亡。

新生大鼠存活情況：對照組新生大鼠87只，死亡2只，死亡率2.30%；模型組新生大鼠共85只，死亡8只，死亡率9.41%；連翹酯苷A組新生大鼠82只，死亡3只，死亡率3.65%；脂多糖組新生大鼠82只，死亡8只，死亡率9.75%；脂多糖+連翹酯苷A組新生大鼠80只，死亡5只，死亡率6.25%。

2.3 新生大鼠呼吸頻率、肺指數測定

與模型組比較，連翹酯苷A組呼吸頻率減慢、肺指數升高，脂多糖組呼吸頻率加快、肺指數降低(P<0.05)；與脂多糖+連翹酯苷A組比較，連翹酯苷A組呼吸頻率減慢、肺指數升高，而脂多糖組呼吸頻率加快、肺指數降低(P<0.05)，見表1。

2.4 ELISA檢測結果

與模型組比較，連翹酯苷A組IL-8、IL-6和IL-1β水平降低，脂多糖組升高(P<0.05)；與脂多糖+連翹酯苷A組比較，連翹酯苷A組IL-8、IL-6和IL-1β水平降低，脂多糖組升高(P<0.05)，見表2。

A：對照組；B：模型組；C：連翹酯苷A組；D：脂多糖組；E：脂多糖+連翹酯苷A組。

表1 新生大鼠呼吸頻率、肺指數比較

2.5 肺組織HE染色

模型組新生大鼠肺泡體積明顯增大，多數肺泡隔增厚，且可見大量炎性細胞浸潤；連翹酯苷A組肺泡稍擴張，少量肺泡隔增厚，少量炎性細胞浸潤；脂多糖組新生大鼠肺組織病理改變較模型組嚴重；脂多糖+連翹酯苷A新生大鼠肺組織病理變化較連翹酯苷A組加重，較脂多糖組減輕，見圖2。

表2 血清IL-8、IL-6和IL-1β水平比較

A：對照組；B：模型組；C：連翹酯苷A組；D：脂多糖組；E：脂多糖+連翹酯苷A組。

2.6 流式細胞儀檢測結果

連翹酯苷A組CD4+/CD8+(1.27±0.10)高于模型組(1.03±0.12)，脂多糖組(0.82±0.17)低于模型組(P<0.05)；脂多糖+連翹酯苷A組CD4+/CD8+(1.15±0.11)低于連翹酯苷A組，高于脂多糖組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.7 Western blot檢測結果

與模型組比較，連翹酯苷A組TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相對表達水平降低，脂多糖組TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相對表達水平升高(P<0.05)；與脂多糖+連翹酯苷A組比較，連翹酯苷A組TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相對表達水平降低，脂多糖組TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相對表達水平升高(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 肺組織中TLR4、p-p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白相對表達水平比較

A：對照組；B：模型組；C：連翹酯苷A組；D：脂多糖組；E：脂多糖+連翹酯苷A組。

3 討 論

宮內感染常通過胎盤垂直傳播造成胎兒先天性感染，胎齡越小，發生宮內感染的概率越高，是引起早產兒不良結局的重要原因[5]。支氣管肺發育不良是早產兒常發生的一種慢性肺部疾病，其主要的病理學改變為肺泡及肺微血管發育不良，而宮內感染引起羊水、胎盤和胎膜中炎性細胞積聚，并分泌大量炎性因子，被認為是支氣管肺發育不良的主要因素[6]。

ZHENG等[7]研究表明連翹酯苷A可調節免疫細胞平衡，降低甲型流感病毒FM1株在小鼠肺臟中引起的炎性反應。此外，連翹酯苷A可減輕脂多糖誘導的肺損傷[8]。T淋巴細胞是免疫反應的中心環節，CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群之間比例失衡可導致免疫反應紊亂，從而引起炎性反應，造成組織損傷。IL-6是炎性反應中重要的炎性遞質，IL-8是啟動炎性反應的關鍵因子[9]。本研究結果顯示宮內感染造成新生大鼠呼吸頻率加快、肺指數降低，連翹酯苷A可減慢呼吸頻率、升高肺指數。宮內感染后新生大鼠肺泡數量明顯減少，且肺泡隔內可見大量炎性細胞浸潤，連翹酯苷A治療后少量炎性細胞浸潤；孕鼠宮內感染造成新生大鼠肺組織中CD4+/CD8+降低，炎性因子IL-6、IL-8和IL-1β水平升高，連翹酯苷A治療后CD4+/CD8+升高、炎性因子水平降低。此結果提示，連翹酯苷A可降低宮內感染新生大鼠炎性反應、改善免疫功能和肺損傷。

脂多糖作用于TRL4受體激活炎癥下游信號通路，NF-κB即為其重要的靶點之一[10]。NF-κB是多種炎性因子基因的靶點，通常以p65/p50組成的異源二聚體形式存在于細胞質中，一般情況下不表現其活性，當細胞受到刺激時，抑制因子IKB發生磷酸化降解，NF-κB解離并活化進入細胞核，調節下游因子表達[11]。NLRP3炎性小體是固有免疫信號通路中重要的多蛋白炎性體，細胞受到刺激時被活化，活化后的NLRP3炎性體切割含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)-1，使其成熟后促進炎性因子前體(pro-IL-1β、IL-18)成熟活化，發揮其生物功能，而炎性因子前體的產生依賴于NF-κB的激活[12]。研究發現，在脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠模型中，肺組織p65、TLR4、NLRP3及caspase-1蛋白表達增加，肺組織損傷嚴重，而喘可治可減輕小鼠肺損傷，降低p65、TLR4、NLRP3及caspase-1蛋白在肺組織中的表達水平[13]。在脂多糖誘導的肺損傷小鼠模型中，脂多糖抑制TLR4/NF-κB p65信號通路激活及NLRP3炎性小體表達，降低氧化應激和炎性反應，改善肺功能障礙[14]。急性膿毒癥大鼠肺組織中p65和TLR4蛋白表達升高，肺水腫明顯，炎性因子水平升高，蘿卜硫素可降低p65和TLR4表達，降低肺水腫程度[15]。本研究通過脂多糖激活TRL4受體，探討連翹酯苷A是否通過該信號通路改善宮內感染新生大鼠肺損傷和免疫功能。結果顯示，脂多糖上調宮內感染新生大鼠肺組織中TLR4、p-p65和NLRP3蛋白表達，而連翹酯苷A治療后可抑制脂多糖的激活作用。此結果提示，連翹酯苷A可抑制TLR4/NF-κB p65/NLRP3信號通路激活。

綜上所述，連翹酯苷A可改善宮內感染新生大鼠肺損傷及免疫功能，其可能是通過抑制TLR4/NF-κB p65/NLRP3信號通路激活發揮作用，為臨床治療肺支氣管發育不良等疾病提供理論依據。