lncRNA PANDAR通過TGF-β/Smad4通路抑制宮頸癌細胞的順鉑耐藥

朱 騫 趙雄濤 張 濰 周冬梅

宮頸癌(cervical cancer)是臨床上常見的惡性腫瘤，據全球癌癥數據統計(the global cancer observatory,GLOBOCAN)2018年報告，宮頸癌是女性的第四大常見惡性腫瘤[1]。衛生部的相關數據顯示，我國每年有超過13 萬宮頸癌新發病例，占全球新發病例數的25%左右，死亡病例約2～3 萬[2]。宮頸癌的診斷數據顯示，將近一半的患者已處于疾病晚期，超過了手術治療的最佳時期[3]，因此化療在宮頸癌的治療中占有重要地位。以順鉑(cisplatin，DDP)為代表的鉑類藥物聯合化療被認為是宮頸癌的標準化療方案[3-4]。在之前的研究中我們發現，LncRNA CDKN1A 反義鏈啟動子DNA 損傷激動RNA(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA，PANDAR)能夠降低宮頸癌細胞株HeLa的順鉑耐藥，并且降低HeLa細胞對順鉑的敏感性[5]。然而PANDAR究竟是通過何種機制抑制HeLa的順鉑耐藥性尚不明確。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞打破細胞間和細胞間基質黏附狀態的重要過程，賦予癌細胞化療耐藥性。本文在前期研究基礎上，通過生物信息學預測PANDAR的靶基因并研究PANDAR介導的EMT在HeLa細胞順鉑耐藥中的作用，旨在明確PANDAR對人宮頸癌細胞株HeLa順鉑耐藥性的作用機制，提供理論依據并完善研究結果。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人宮頸癌HeLa細胞株購自上海拜力公司，順鉑購自Sigma 公司，HeLa-DDP耐藥細胞株為本實驗前期建立。LV-sh-PANDAR 慢病毒載體購自和元生物技術(上海)股份有限公司。RIPA裂解液和牛血清白蛋白購自美國Sigma公司，CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所。轉化生長因子-β1(transforming growth factor 1，TGF-β1)抗體，Smad4抗體，鈣粘附蛋白E(E-cadherin)抗體及鈣粘附蛋白N(N-cadherin)抗體購自Abcam。

1.2 細胞培養

HeLa 細胞培養在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養液中，于5%CO2，37°C培養箱中培養。HeLa-DDP耐藥細胞株由本實驗前期建立，采用藥物濃度梯度遞增法獲得[5]。

1.3 蛋白提取和免疫印跡Western blot

收集HeLa或HeLa-DDP細胞，棄掉培養液后每孔加入1 ml RIPA裂解液，冰上裂解10 min。BCA試劑盒檢測裂解液蛋白濃度。每孔加入15 μg蛋白于聚丙烯酰胺凝膠上并進行電泳，電轉至PVDF膜上；隨后用5%牛血清白蛋白封閉1 h。4 ℃條件下一抗(E-cadherin，N-cadherin，TGF-β，Smad4)孵育PVDF膜并過夜，隨后二抗孵育。ECL發光試劑盒檢測目的蛋白的表達，Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析目的條帶。

1.4 PANDAR靶基因預測

通過lncATLAS網站 (https://lncatlas.crg.eu/)預測PANDAR評估PANDAR的定位(位于細胞核)。通過RNAInter網站(http://www.rna-society.org/rnainter/)預測PANDAR潛在的靶基因；根據已有的實驗結果和文獻報道篩選靶基因。

1.5 CCK-8檢測

0.25%胰蛋白酶消化細胞后計數，以5×104個細胞/孔的密度接種于6孔板，分別用不同濃度(0、1、2、4、8和16 μg/ml)順鉑處理，48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h，酶標儀上測定每孔在450 nm處的吸光值。

1.6 流式檢測細胞凋亡

0.25%胰蛋白酶消化HeLa-DDP細胞并計數，以5×105個細胞/孔的密度接種在6孔板，37 ℃培養過夜。用無血清的培養基處理細胞8 h后加入10 ng/ml的TGF-β，37 ℃作用36 h。收集細胞，將細胞重懸于400 μL Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min，加入10 μL PI并混勻，冰浴避光放置5 min，30 min內于流式細胞儀上檢測細胞凋亡。細胞隨機分為四組：PANDAR，PANDAR + TGF-β，PANDAR + Cisplatin和PANDAR + Cisplatin + TGF-β。

1.7 統計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及Bonferroni事后檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態及EMT標志分子表達

顯微鏡下觀察HeLa細胞及HeLa-DDP細胞形態發現，HeLa細胞形態規則，呈圓形或卵圓形，細胞間緊密相連。HeLa-DDP細胞形態不規則，呈長梭形，細胞間疏散。Western blot結果表明，與HeLa細胞相比，HeLa-DDP細胞中上皮標志物E-cadherin表達量下調，而間質分子標志物N-cadherin表達量上調(圖1)。表明HeLa-DDP細胞發生了EMT變化。

圖1 HeLa細胞及HeLa-DDP細胞形態及EMT標志分子表達

2.2 PANDAR對HeLa-DDP細胞EMT發生的影響

PANDAR過表達載體處理HeLa-DDP細胞，光學顯微鏡結果顯示HeLa-DDPControl及HeLa-DDPNC細胞呈長梭形，而HeLa-DDPPANDAR細胞多呈圓形或卵圓形。Western blot結果表明與HeLa-DDPNC細胞相比，HeLa-DDPPANDAR細胞中E-cadherin表達量上升，N-cadherin表達量下降(圖2A)。

光學顯微鏡結果顯示，HeLa-DDPsh-PANDAR細胞與HeLa-DDPsh-NC細胞形態上差別不大，均呈長梭形。Western blot結果表明與HeLa-DDPsh-NC細胞相比，HeLa-DDPsh-PANDAR細胞E-cadherin表達量下降，N-cadherin表達量上升(圖2B)。

A為Western blot檢測PANDAR過表達對E-cadherin及N-cadherin表達水平的影響；B為Western blot檢測PANDAR敲減對E-cadherin及N-cadherin表達水平的影響。

2.3 PANDAR對HeLa細胞TGF-β/Smad4通路的影響

RNAInter預測網站(http://www.rna-society.org/rnainter/)顯示Smad4為PANDAR潛在的靶基因，且這一預測結果得到ChIP-seq分析數據的支持[6-7]。Western blot結果顯示，與HeLaNC細胞中TGF-β(0.96±0.13)和Smad4 (1.07±0.15)蛋白相對表達水平比較，HeLaPANDAR細胞中TGF-β(0.28±0.06)和Smad4(0.38±0.03)蛋白的相對表達水平較低，差異有統計學意義(P<0.05，圖3A～B)。

HeLash-PANDAR細胞TGF-β蛋白相對表達水平為2.13±0.15，Smad4蛋白相對表達水平為2.67±0.18，與 HeLash-NC細胞(TGF-β：1.03±0.06；Smad4：1.05±0.03)比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3C～D。

A為PANDAR過表達后TGF-β及Smad4蛋白表達水平；B為PANDAR過表達后TGF-β及Smad4蛋白相對定量結果；C為PANDAR敲減后TGF-β及Smad4蛋白表達水平；D為PANDAR敲減后TGF-β及Smad4蛋白相對定量結果。

2.4 TGF-β逆轉PANDAR對EMT的影響

PANDAR過表達的HeLa/DDP細胞，加入10 ng/ml的TGF-β處理，檢測EMT標志蛋白水平的變化。光學顯微鏡顯示，TGF-β處理的HeLa-DDPPANDAR細胞排列不規則，多呈長梭形，細胞間疏散。Western blot結果顯示，與HeLa-DDPPANDAR細胞中E-cadherin(1.00±0.08)和N-cadherin(1.00±0.03)蛋白相對表達水平比較，HeLa-DDPPANDAR+TGF-β細胞中E-cadherin蛋白表達水平(0.46±0.06)相對降低，N-cadherin蛋白相對表達水平(2.58±0.13)升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。

圖4 Western blot檢測E-cadherin及N-cadherin表達水平

2.5 TGF-β逆轉PANDAR介導的HeLa-DDP細胞Cisplatin耐受

如圖5A顯示，隨著Cisplatin濃度升高，HeLa-DDPPANDAR細胞OD450值逐漸降低。與TGF-β未處理相比，TGF-β處理的HeLa-DDPPANDAR細胞OD450值上調(圖5A)。TGF-β處理顯著降低Cisplatin誘導的HeLa-DDPPANDAR細胞凋亡(P<0.05)，見圖5B～C。

注：A為CCK-8實驗檢測細胞活力；B為細胞凋亡定量結果；C為流式細胞術檢測細胞凋亡。

3 討論

本文研究發現，PANDAR抑制HeLa-DDP細胞的EMT進程。PANDAR過表達后TGF-β和Smad4蛋白表達水平顯著降低。TGF-β逆轉了PANDAR介導的HeLa-DDP細胞EMT進程和Cisplatin耐藥。

在不同腫瘤中，PANDAR起著抑癌或促癌的作用[8]。據報道，PANDAR可與精氨酸/絲氨酸豐富剪接因子2(SRSF2)結合，調控p53蛋白絲氨酸15磷酸化，從而降低順鉑敏感性[9]。我們的前期研究發現，PANDAR過表達可以降低HeLa-DDP細胞對Cisplatin耐受性[5]。EMT過程可通過將靜止的上皮細胞轉化為可移動的間充質細胞并改變細胞-細胞粘附以及細胞外基質，從而顯著促進癌細胞侵襲和化學耐藥性[10-11]。在乳腺癌，黑色素瘤及結直腸癌細胞中，PANDAR敲除導致間充質標志分子(如N-鈣粘蛋白，波形蛋白，β-連環蛋白)表達降低，E-鈣粘蛋白表達升高，抑制EMT過程[12,13]。在本研究中，我們發現HeLa-DDP細胞呈現出明顯的間質特性，PANDAR過表達抑制了耐藥細胞的EMT進程，而PANDAR敲除促進耐藥細胞的EMT進程。PANDAR在不同腫瘤中對EMT的作用可能與腫瘤的異質性和PANDAR復雜的調節機制有關。

通過lncATLAS網站(https://lncatlas.crg.eu/)得知，lncRNA PANDAR主要定位于細胞核中。Zhang[14]等在肺癌細胞中也發現PANDAR主要定位于細胞核中，并通過上調芐氯素1(BECN1)激活自噬和凋亡途徑，進而抑制肺癌發展進程。PANDAR的細胞核定位決定了其可通過直接與靶基因結合來激活或抑制靶基因的表達。通過ChIP-seq分析結果發現，PANDAR能與Smad4結合[6-7]。Smad4在TGF-β作用下，可轉移到細胞核內并于轉錄因子一起介導靶基因的抑制或激活。研究表明，腫瘤微環境中接近腫瘤血管的癌癥干細胞接受并響應TGF-β信號，使癌癥干細胞細胞分裂變緩，從而避開一些靶向快速分裂細胞的抗癌療法(如順鉑治療)[15]。此外，TGF-β/Smad4信號通路通過誘導Snail1/2，ZEB1/2等轉錄因子的表達，促進誘導細胞發生EMT變化，使細胞對化療藥物表現出更強的耐受性[16-17]。本文研究發現，PANDAR的過表達顯著下調了TGF-β和Smad4蛋白的表達水平；TGF-β處理PANDAR過表達的HeLa-DDP細胞，研究PANDAR過表達對HeLa-DDP細胞EMT進程和耐藥性影響的機制，結果證明TGF-β可逆轉PANDAR 過表達對HeLa-DDP細胞EMT的抑制作用。此外，TGF-β過表達逆轉了PANDAR過表達誘導的HeLa-DDP細胞凋亡。考慮到TGF-β介導凋亡和EMT是一個相互排斥和相互關聯、受到某些因素調控并因此處于動態平衡的過程[18]，提示PANDAR可能通過TGF-β/Smad4調控宮頸癌EMT和凋亡的動態平衡過程。

綜上所述，聯合前期的研究成果，我們發現了PANDAR調節HeLa-DDP細胞耐藥性較完整的分子機制，即PANDAR通過抑制TGF-β/Smad4通路影響HeLa細胞的EMT進程，進而影響其耐藥性。這一研究發現為減輕宮頸癌的耐藥性和探索更有效的治療方法提供了理論依據。