牛磺酸對人宮頸癌細胞侵襲轉移的抑制作用及機制研究

梁笑傾 萬慧芳 劉卓琦 萬福生

宮頸癌(cervical cancer)是女性常見的婦科惡性腫瘤，且近年來發病率呈明顯上升和年輕化趨勢[1]。目前治療宮頸癌的主要有效方法是手術、放療及手術聯合放化療的綜合治療，然對于復發轉移、晚期宮頸癌患者療效較差[2]。宮頸癌的侵襲轉移過程極其復雜，具體機制仍不甚明確[3]。最近有研究顯示[4]一些藥物及抑癌基因對人宮頸癌HeLa細胞可能通過調控代表上皮特征的E-cadherin、代表間質特征的N-cadherin 及基質金屬蛋白酶2/9(MMP2、MMP9)表達,進而逆轉上皮-間質轉化(EMT)的發生,發揮抑制宮頸癌侵襲轉移的作用。

牛磺酸(Taurine,Tau)化學名為2-氨基乙磺酸，是一種內源性細胞保護物質，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調節胞內鈣平衡及免疫調節等多種生物學功能[5]。近年發現[6-7]Tau可誘導宮頸癌等多種癌細胞凋亡，抑制結直腸癌與乳腺癌的生長及侵襲遷移，但Tau對宮頸癌細胞侵襲轉移的影響如何尚未見報道。本文利用宮頸癌Hela細胞探討了Tau對人宮頸癌細胞侵襲轉移的影響及其分子機制，旨在為宮頸癌的防治提供新的思路和手段。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人宮頸癌細胞Hela細胞株購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。牛磺酸(SLBP8056V，Sigma公司)，胰蛋白酶、RPMI-1640 培養基、細胞裂解液均購自于Solarbio 公司，CCK8試劑(上海東仁化學科技有限公司)。GSK-3β單克隆抗體(Cat.Ab32391) ，pho-GSK-3β(Ser9)單克隆抗體(Cat.ab75814) ，E-cadherin單克隆抗體(Cat.Ab1416，Abcam公司)，N-cadherin多克隆抗體(Cat.Ab18203),Vimentin單克隆抗體(Cat.Ab92547),MMP2多克隆抗體(Cat.Ab37150),MMP7多克隆抗體(Cat.Ab5706),MMP9多克隆抗體(Cat.Ab38898),辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZB-2301)北京中杉金橋公司。

1.2 CCK8檢測細胞增殖活性

用0.25%胰酶在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中進行消化及37 ℃、5% CO2培養箱內常規傳代培養,取對數生長期細胞進行后續實驗。實驗分組如下：空白對照組(Control，不含Tau)、Tau 20 mmol/L 組、Tau 40 mmol/L組、Tau 80 mmol/L組和Tau 160 mmol/L組。

取經胰酶消化制成密度約3×104個/mL單細胞懸液，以100 μL每孔接種于96孔板中，共接種3塊96孔板(每組設3個復孔)。經培養過夜后，棄去舊的培養基，換成含不同溶度Tau(0、20、40、80、160 mmol/L)的完全培養基，分別作用24 h、48 h、72 h。從第二天開始，每隔12 h取1塊96孔板，更換并加入100 μL新培養基(其中含有10 μL CCK8)，孵育3 h。在波長450 nm處測定其吸光度值。實驗重復3次。

1.3 Transwell小室檢測細胞遷移能力

將生長良好的人宮頸癌Hela細胞用不含血清的培養基饑餓處理12 h，然后用含0.25% EDTA的胰酶消化，并用完全培養基終止消化，無血清培養基制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×105個/mL。在Transwell小室的上室內加入200 μL上述細胞懸液，24孔板中的下室加入600 μL含不同濃度Tau的10%血清的培養基，小室置于24孔板中，處理48 h。然后用棉簽擦去上室細胞，PBS清洗3次后用4%細胞組織固定液固定細胞20 min，晾干后用1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌3次。小室干燥后在倒置顯微鏡下觀察并使用圖像采集系統選取上、中、下、左、右5個視野于100倍鏡下進行觀察并拍照，計數并求其平均穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.4 Transwell小室檢測宮頸癌Hela細胞侵襲能力

先將Matrigel膠分別與不含血清的H-DMEM和RPMI-1640基礎培養基按1∶8的比例混合均勻(在冰上進行)。取該混合物60 μL鋪于已預冷的小室中，將小室置于24孔板中，在37 ℃恒溫培養箱中過夜凝固成膠狀。然后接種細胞于小室中，接種于小室的細胞數為2×105個/孔，其余步驟與Transwell小室遷移實驗一致，計算細胞侵襲能力。實驗重復了3次。

1.5 用Western blot檢測宮頸癌細胞中蛋白水平

收集經Tau處理48 h的宮頸癌細胞，在冰上用 RIPA 細胞裂解液進行裂解，12000 r/min離心(4 ℃)10 min，取上清液。采用 PierceBCA ProteinAssayKit試劑盒檢測蛋白濃度，按20 μg蛋白上樣量將蛋白樣品與上樣緩沖液(5×) 按 4∶1 的體積比例混合，沸水中煮5 min使蛋白變性。冷卻后，經10%SDS-PAGE并半干電泳轉至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入PTEN、AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、 β-catenin等一抗抗體，4 ℃ 孵育過夜。次日在室溫下加入二抗再孵育2 h，以ECL化學發光法顯色，X線膠片曝光成像，掃描儀掃描蛋白條帶。

1.6 統計學處理

應用SPSS 20.0軟件統計分析，組間進行單因素方差(one-way ANOVA)，假若方差齊性，則使用LSD (L)法進行兩兩比較，若方差不齊性時，使用Dunnett,s (T3)法分析，以P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 Tau對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用

用不同濃度Tau(0、20、40、80和160 mmol/L)分別處理宮頸癌Hela細胞不同時間段(24 h、48 h和72 h),利用CCK8檢測Tau在不同濃度和時間對Hela細胞增殖的影響。結果如下圖所示(圖1)。結果顯示，濃度為20～160 mmol/L的Tau分別作用細胞24 h、48 h和72 h后，對Hela細胞增殖均有不同程度的抑制作用(P<0.05)，且呈一定的量效關系和時效關系。

圖1 Tau對人宮頸癌Hela細胞增殖的影響

2.2 Tau對宮頸癌Hela細胞侵襲和遷移的影響

利用Transwell小室觀察不同濃度Tau對Hela細胞侵襲與遷移的影響，以證實Tau處理濃度及時間效應關系。結果見圖2。結果顯示，經Tau處理細胞48 h后，Hela細胞的遷移和侵襲能力，隨著Tau濃度的升高，穿膜細胞的數量逐漸減少，表明Hela細胞的遷移和侵襲能力明顯逐漸下降。

圖2 Tau對人宮頸癌Hele細胞的侵襲和遷移的影響

2.3 Tau對宮頸癌Hela細胞中上皮-間質轉化(EMT)相關蛋白和MMPS蛋白表達的影響

采用Western blot檢測Hela細胞中EMT相關標志蛋白的表達變化及MMPS蛋白表達的影響。結果顯示，經Tau處理細胞48 h后，隨著Tau濃度的增加，Hela細胞中代表上皮特征的E-Cadherin蛋白表達呈顯著上調；相反代表間質特征的N-Cadherin和Vimen-tin則出現表達下降(圖3)，此結果表明Tau可以阻礙EMT的發生發展進程。同樣，細胞中MMP2、MMP7、MMP9的蛋白表達也隨著Tau濃度的增加有明顯逐漸降低(圖4)，表明Tau可抑制Hela細胞中MMP2、MMP7、MMP9的表達，且呈劑量依賴性。

圖3 Tau對人宮頸癌細胞中EMT相關蛋白表達的影響

圖4 Tau對人宮頸癌Hele細胞中 MMPs蛋白表達的影響

2.4 Tau對宮頸癌Hele細胞中AKT/GSK-3β/β-Catenin通路的影響

通過免疫印跡分析細胞中PTEN、GSK-3β、AKT和β-catenin 的蛋白水平變化，結果發現(圖5)，經Tau處理48 h后，Hele細胞中PTEN、GSK-3β蛋白水平隨著Tau濃度的增高而逐漸升高，且p-AKT水平也逐漸增高；相反，AKT和β-catenin表達則隨著Tau濃度的增大而逐漸減弱，p-GSK-3β水平也逐漸下降。這些結果表明，Tau可促進PTEN、GSK-3β的表達，并通過調控 AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路，調控宮頸癌細胞的侵襲轉移。

圖5 AKT/GSK-3β/β-Catenin通路相關蛋白表達的變化

3 討論

宮頸癌易于深浸宮頸間質、血管淋巴間隙，較早出現轉移，這也是宮頸癌預后較差的原因。宮頸癌的發生及其侵襲轉移是由一系列基因調控、多種機制共同作用的動態生物學過程，多種癌基因和抑癌基因通過參與癌細胞自噬及凋亡途徑而發揮促進或抑制腫瘤生長的效應，如PI3K、AKT、Bax、BcL-2等[8]。Tau對宮頸癌Hela細胞侵襲轉移與PI3K/AKT/GSK-3β/β-Catenin通路的影響如何尚未見報道。有研究表明，宮頸癌患者體內有Akt基因突變[9]，宮頸癌的致癌基因與p53相互作用可調控宮頸癌細胞中的PI3K/Akt信號通路[10]。PI3K位于Ras信號通路的下游，PI3K/Akt/GSK-3β是最重要的信號轉導途徑之一，在調節細胞增殖、存活和侵襲中起主要作用。PI3K不僅是癌細胞形成的主因之一，還導致癌細胞的大量繁殖。PI3K激活AKT、GSK-3等下游分子，將多種生長因子及細胞因子的信號傳遞到細胞內，從而對細胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖轉運起重要的調節作用。故PI3K/Akt信號通路的激活是實體瘤細胞生長和生存的主要決定因素[11]。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是AKT/GSK-3β信號通路調控上皮-間充質轉化(EMT)的關鍵分子，與腫瘤侵襲轉移密切相關[12]。最近許多研究認為GSK-3β可作為多種不同類型癌癥的一個潛在的治療靶點[13]，在控制癌細胞侵襲和遷移方面發揮重要作用。PTEN(腫瘤抑制因子)是PI3K/Akt信號通路的重要負調節因子。PTEN通過降低AKT的磷酸化水平，從而阻斷PI3K/Akt信號通路激活，使PI3K/Akt蛋白水平降低，促進癌細胞凋亡。故PTEN增多，抑制PI3K/Akt信號通路，進而抑制細胞的增殖、存活。本研究中發現Hele細胞中隨著Tau濃度增加，PTEN 蛋白水平升高，AKT降低，GSK-3β濃度升高，細胞增殖抑制。

橙皮素可通過調控TGF-β1/Smad信號通路干預宮頸癌EMT過程和抑制宮頸癌細胞侵襲轉移[14]。有研究發現Tau可協同順鉑發揮抑制宮頸癌生長[15]，與其他化療藥物合用，對腫瘤治療具有增效減毒作用[16]。我們前期研究發現牛磺酸可通過上調人哺乳動物不育系20樣激酶1(MST1)蛋白表達誘導宮頸癌細胞凋亡[6,17]，但Tau對宮頸癌侵襲轉移的治療效果如何尚未完全清楚。上皮-間充質轉化(EMT)的激活是癌細胞轉移的關鍵過程，典型特征是上皮分子標志物(E-Cadherin)的丟失和間質細胞標志物(Vim-enin/N-Cadherin)的表達上調，即E-Cadherin與上皮癌的進展、局部浸潤和轉移呈負相關。本文以宮頸癌Hela細胞為對象，通過Transwell小室和Western blot方法，探討了Tau對宮頸癌細胞遷移和侵襲能力的影響及其可能機制。結果顯示，Tau能顯著性降低宮頸癌Hela細胞的遷移和侵襲能力，且呈劑量依賴性；同時，Tau能顯著性降低Hela細胞中代表間質細胞特征的N-Cadherin和Vimentin的表達，提高代表上皮細胞特征的E-Cadherin的表達。此結果提示Tau不僅有抑制宮頸癌Hela細胞遷移和侵襲的作用，還可能具有阻止或逆轉Hela細胞的EMT作用，類似報道是Tau對乳腺癌細胞EMT有較好的抑制作用[7]。

腫瘤的浸潤和遠處轉移，還與血管快速生長密切相關。基質金屬蛋白酶(MMP)是血管快速生長影響因素之一。本研究中發現，MMP濃度隨Tau濃度的增大而降低，細胞凋亡增加。表明Tau抑制腫瘤細胞遠處轉移，可通過抑制MMP濃度，且呈劑量負相關。

Wnt/β-Catenin信號通路中的β-Catenin是一種多功能蛋白質，在細胞連接處與代表上皮細胞特征的E-Cadherixn相互作用，參與黏合帶形成。過多的游離β-Catenin進入細胞核，引起腫瘤發生。本研究中發現，試驗組隨著Tau濃度增加，β-Catenin濃度減少，細胞凋亡增多。

本文實驗結果顯示，Tau能劑量依賴性地提高Hele細胞中GSK-3β、PTEN蛋白水平，并使AKT蛋白磷酸化水平增強，AKT水平降低；另一方面，β-catenin表達則隨著Tau濃度的增大而逐漸減弱。結果表明Tau促進宮頸癌Hela細胞凋亡，抑制EMT轉化，并通過調控PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路，最終達到抑制宮頸癌細胞侵襲轉移。