雷公藤內酯醇逆轉卵巢腫瘤微環境的體內實驗研究

陳燕晶 楊麗蘭 譚布珍 胡 輝

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，其發病率僅次于宮頸癌和子宮體癌，但死亡率卻居婦科腫瘤首位，嚴重威脅女性生命和健康[1]。卵巢癌診斷時大部分有腹盆腔轉移，確診時多屬中晚期，卵巢癌浸潤、轉移是造成卵巢癌治療困難的主要原因[2]。腫瘤細胞耐藥的發生和化療藥物產生的不良反應嚴重影響著其治療效果，甚至導致化療失敗、腫瘤復發[3]。盡管最近在手術和化療方面取得了進展，但總的來說卵巢癌患者5年生存率僅為40%[4]。為了提高卵巢癌的診斷和治療水平，有必要進一步了解卵巢癌發病的分子機制。大量研究表明，腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移和耐藥機制復雜[5-10]。

從天然產物中尋找抗腫瘤活性成分是發展抗腫瘤藥物的重要策略之一，雷公藤是我國一種資源比較豐富的傳統中草藥，其結構多樣，有效成分具有明顯的抗炎、免疫抑制和抗腫瘤等作用。雷公藤內酯醇(TP)作為最著名的天然產物之一，長期以來在中國被用作類風濕性關節炎的消炎藥，也被認為是治療各種癌癥的潛在藥物[11-17]，盡管有研究表明其對動物肝臟、腎臟、睪丸、卵巢和心臟有潛在毒性[18]。有研究表明，TP對各種癌癥模型具有廣泛的抗癌作用[19-24]。近年來隨著對耐藥性腫瘤研究的深入，大量研究證實，TP比傳統抗腫瘤藥物如紫杉醇、順鉑、多柔比星等具有更強的抗腫瘤活性[25]，且某些對傳統藥物耐藥的腫瘤細胞，對雷公藤內酯醇卻十分敏感。我們課題組長期以來一直研究雷公藤內酯醇對耐順鉑人上皮性卵巢癌的抑制作用，取得了一定的研究成果。本研究采用SKOV3細胞小鼠成瘤模型研究了TP的抗癌作用，并通過分析腫瘤微環境相關細胞因子及蛋白表達的改變研究TP的抗癌作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及動物

SKOV3細胞(購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)；BALB/c-nu小鼠6只(生產廠家：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；許可證號SCXK(湘)2016-0002)

1.2 實驗試劑與儀器

DMEM完全高糖培養液(凱基生物 KGM12800S-500)；雷公藤內酯醇(ST8290Solarbio)；TUNEL檢測試劑盒(C1088，碧云天)；RIPA細胞裂解液(C1053，北京普利萊基因技術有限公司)；PVDF膜(IPVH00010，Millipore)；超敏發光液(RJ239676，賽默飛)；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH(TA-08，中杉金橋，1/2000)；辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305，中杉金橋,1/2000)；Rabbit Polyclonal Anti-BDNF ((DF6387，Affinity，1/1000)；Rabbit Polyclonal Anti-TrkB (AF6461，Affinity，1/1000)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301，中杉金橋，1/2000)；酶標儀(RT-6100，Rayto)；蛋白垂直電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)；超高靈敏度化學發光成像系統(Chemi DocTM XRS+，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)；顯微鏡(CX41 OLYMPUS)。

1.3 細胞培養

收集細胞后，棄去培養上清，1×PBS洗兩遍，0.25%胰酶(含0.02% EDTA)在37 ℃培養箱中消化2 min，加入培養基終止消化并懸起細胞；收集細胞至10 ml離心管中，1000 rpm離心3 min，棄盡上清，加入培養基吸管吹勻；將上述細胞懸液稀釋至適宜細胞密度后加入準備好的培養皿中，置于37℃5% CO2培養箱中培養。

1.4 裸鼠成瘤

每只Balb/c-nu小鼠均進行右側腋下皮下注射接種SKOV3細胞5×106個，每2天測量一次裸鼠體重并使用游標卡尺測量裸鼠的腫瘤大小，當腫瘤長到5 mm左右時開始腹腔注射給藥。

1.5 實驗分組

SKOV3組：每只裸鼠按0.15 ml/10 g劑量腹腔注射生理鹽水。1次/天，連續給藥14天；SKOV3+雷公藤內酯醇(8 ng/ml)組：每只裸鼠按0.15 ml/10 g劑量腹腔注射10 μg/ml的雷公藤內酯醇注射液，1次/天，連續給藥14天。外周血取樣：摘眼球法取血，靜置后離心取上清用于ELISA檢測；處死：裸鼠頸椎脫臼處死；切開瘤體處皮膚，暴露皮下組織并仔細觀察瘤體；用手術剪與手術鑷分離瘤體與周邊組織，將腫瘤完整剝離；將取下的瘤體用電子天平稱重并記錄，用游標卡尺測瘤體大小，記錄并拍照實驗數據；將取下的瘤體一部分置于10%甲醛溶液內固定并存放于4 ℃冰箱內。用于HE、免疫組化、TUNEL檢測。剩余的部分用于WB檢測。ELISA檢測、WESTERN-blot檢測、TUNEL染色檢測凋亡、HE染色及免疫組化均按試劑盒步驟操作。

1.6 統計學分析

所有數據均采用SPSS 19.0進行統計分析，經t檢驗判定顯著性差異，以P<0.05作為顯著性差異(P<0.05)。

2 結果

2.1 成瘤大小

表1可見，SKOV3+TP組成瘤體積大小明顯小于SKOV3組成瘤體積大小(P<0.05)。

表1 2組成瘤體積大小比較

2.2 血清IL-2、HIF-1α、TNF-α和CSF-1比較

加入TP干預后，SKOV3+TP組中血清IL-2及TNF-α都明顯高于SKOV3組，兩者之間差異有統計學意義(P<0.05)；而SKOV3+TP組中血清HIF-1α及CSF-1都明顯低于SKOV3，兩者之間差異有統計學意義(P<0.05),見圖1。

圖1 2組中各細胞因子的比較

2.3 腫瘤凋亡檢測

如表2所示，SKOV3+TP組細胞凋亡數明顯多于SKOV3組(P<0.05)。

表2 2組細胞凋亡數比較

2.4 2組HE染色及免疫組化

HE染色可見細胞異型性，核漿比增高，存在巨核和多核改變。表3可見：SKOV3組MMP-2中腫瘤細胞絕大部分胞漿呈棕黃色，陽性率達100%；SKOV3+TP組MMP-2中腫瘤細胞部分胞漿呈淡黃色，陽性率為16.7%。表4可見：SKOV3組VEGF-1中腫瘤細胞絕大部分胞漿呈棕黃色，陽性率達100%，SKOV3+TP組VEGF-1中腫瘤細胞部分胞漿呈淡黃色，陽性率為0%。

表3 2組MMP-2蛋白表達陽性率比較

表4 2組VEGF-1蛋白表達陽性率比較

2.5 2組MMP-2 和VEGF-1蛋白表達的差異

如圖2所示：TP作用后，腫瘤組織中MMP-2及VEGF-1蛋白表達明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)

圖2 2組MPP-2 和VEGF-1蛋白表達情況

3 討論

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統惡性腫瘤，其病理類型眾多，以上皮性最為常見。順鉑在發揮抗腫瘤效用的同時，激活了細胞內抗凋亡通路，從而削弱了癌細胞對順鉑的敏感性，成為順鉑充分發揮其抗腫瘤效用的絆腳石[26]。雷公藤內酯醇作為一種著名的植物化學物質，通過抑制腫瘤細胞的增殖和誘導多種腫瘤的凋亡來實現其多效性抗癌活性[27]。TP在體內外均具有抑制癌細胞增殖和誘導癌細胞凋亡的作用。TP還被證實在誘導耐藥多發性骨髓瘤和宮頸癌細胞凋亡方面有效[28]。我們前期工作發現TP對耐順鉑上皮性卵巢癌的抑制作用機制[29-33]，主要研究了TP作用于凋亡信號通路抑制腫瘤細胞的生長。本研究圍繞腫瘤微環境，通過體內裸鼠成瘤實驗發現，TP可以抑制SKOV3細胞腫瘤大小，通過改變腫瘤微環境，促進腫瘤發生凋亡。

CSF-1是具有多種生物學功能的細胞因子，有多種細胞可以產生CSF-1，它能刺激單核吞噬細胞家族的增殖、分化與存活，CSF-1的主要功能之一就是刺激巨噬細胞的分化和生長[34]。有研究表明，CSF-1在許多惡性腫瘤中異常高表達[35]。CSF-1在卵巢癌中是高表達的[36]。由于腫瘤細胞周圍存在局部缺氧環境，因此腫瘤細胞需要通過基因表達的改變，如上調缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)激活細胞增殖，促進血管新生和下調細胞凋亡水平適應整個腫瘤微環境的變化，使其在缺氧條件下繼續存活甚至進行增殖。隨著研究的不斷深入，監測腫瘤組織中HIF-1α和血管內皮生長因子VEGF的表達輔助卵巢癌的早期診斷和預測其侵襲性，已受到越來越多的關注[37]。細胞因子是由免疫系統細胞以及其他多種類型的細胞分泌的一類小分子蛋白質，包括淋巴因子、干擾素(IFN)、IL、TNF和集落刺激因子等。有研究已證實IL誘導NO合成是其抗腫瘤作用的機制之一，不僅IL能作用于腫瘤細胞發揮作用，其他類別的IL也能參與到腫瘤細胞的進展機制中[38]。TNF主要是由活化的單核或巨噬細胞產生，能殺傷和抑制腫瘤細胞，促進中性 粒細胞聚集吞噬，可引起卵巢表面上皮細胞生長，降低卵巢癌細胞生長，可使約40%的腫瘤MHC-I、腫瘤抗原提呈蛋白表達增強[39]。本研究實驗結果表明，通過加入TP后會引起SKOV3腫瘤血清中的IL-2及TNF-α上升，血清HIF-1α和CSF-1下降，從而影響了腫瘤的生長。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與降解全身各種組織細胞外基質(extra-cellularmatrix，ECM)的蛋白酶家族。MMP-2在腫瘤的血管化、腫瘤細胞的侵襲和轉移灶的形成過程起重要作用。MMP-2具有降解血管基底膜中的膠原的能力，與腫瘤新生血管形成和生理條件下及病理條件下腫瘤轉移等有關。MMP-2的表達和活性水平的改變與多種癌癥的轉移密切相關。有研究表明，雷公藤內酯醇會抑制腫瘤細胞MMP-2的表達[40-46]，其中眾多的生長因子參與了腫瘤生理病理血管的生成過程，尤其是血管內皮生長因子(VEGF)的調控作用最為重要[47]。有研究表明，VEGF在卵巢癌組織中是高表達，且高表達 VEGF的卵巢癌更易發生腹膜轉移。VEGF是促進增殖、遷移和毛細血管生長的關鍵血管生成因子[48-49]。本研究實驗結果表明，通過加入TP后會引起SKOV3腫瘤組織中的MMP-2和VEGF表達下降，這結果說明TP可能是通過抑制MMP-2和VEGF表達，從而影響了腫瘤的生長，誘導凋亡發生。

綜上所述，雷公藤內酯醇具有顯著抑制人上皮性卵巢癌細胞SKOV3的增殖，并誘導其凋亡的作用。TP作用SKOV3細胞株后，血清CSF-1、HIF-1α和組織中MMP-2和VEGF表達會下降，通過上調血清IL-2及TNF-α表達，改變腫瘤微環境，從而影響腫瘤細胞的生長，最終誘導腫瘤發生凋亡。