HPLC 法測定不同廠家小兒止咳糖漿中防腐劑的含量*

時 佩，馮有龍，魯寅生，黃 萍

1 南京中醫藥大學 藥學院，南京 210023；2 江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 210019

小兒止咳糖漿具有祛痰鎮咳的功效，臨床用于治療小兒感冒引起的咳嗽和急性支氣管炎[1]。其處方是由甘草流浸膏、桔梗流浸膏、橙皮酊、氯化銨4 味、另加防腐劑苯甲酸鈉和矯味劑香蘭素組成。甘草具有化痰止咳、緩急止痛、調和藥性等作用[2]；桔梗宣肺利咽、祛痰排膿[3]；橙皮燥濕健脾、祛痰止咳[4]。該制劑質量標準原載于《衛生部藥品標準》之“中藥成方制劑標準”第五冊，后被《中國藥典》2010 年版收錄，2015 年版和2020 年版藥典沿用。從國家藥監局查詢到目前小兒止咳糖漿共有176 個批準文號。通常生產企業為了控制藥品中微生物污染，需要添加一定量的防腐劑，而糖漿劑中常添加防腐劑，包括苯甲酸、山梨酸和對羥基苯甲酸酯類。《中國藥典》對糖漿劑中防腐劑用量限度有明確規定；但是該制劑的質量標準并未對其進行質量控制。文獻報道的小兒止咳糖漿中防腐劑的含量測定方法為MEKC 法[5]。為了更有效了解市售小兒止咳糖漿中防腐劑的種類和用量情況，現建立了小兒止咳糖漿中苯甲酸等6 種防腐劑的含量測定方法，可為該品中防腐劑的含量控制提供科學依據。

1 材 料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，LC solution 色譜工作站[島津企業管理（中國）有限公司，日本，型號：LC-20AB]；百萬分之一電子天平（Mettler Toledo 公司，瑞士，型號：XP6）；超聲波清洗器（Branson 公司，美國，型號：B5510E-DTH）。

1.2 藥品與試劑

苯甲酸對照品（批號100419-201703，純度99.9%）、山梨酸對照品（批號190126-201501，純度99.6%）、對羥基苯甲酸甲酯對照品（批號100278-201906，純度100%）、對羥基苯甲酸乙酯對照品（批號100847-201604，純度99.0%）、對羥基苯甲酸丙酯對照品（批號100444-202005，純度99.6%）、對羥基苯甲酸丁酯對照品（批號110792-200503，純度100%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 分析樣品

62 個生產廠家提供79 批小兒止咳糖漿樣品。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 分別精密稱取苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯對照品適量，加50%甲醇配制成質量濃度分別為0.203、0.203、0.205、0.207、0.0.207、0.206 mg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密量取樣品2 mL，置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液 按小兒止咳糖漿處方比例稱取除苯甲酸鈉以外的其他藥味，制成不含苯甲酸鈉的陰性供試品[6]，再按“2.1.2”項下方法制備不含苯甲酸鈉的陰性對照溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol·L-1醋酸銨溶液（pH 3.00）（A）-甲醇（B），進行梯度洗脫（0～30 min，85%→60%A；30～50 min，60%→20%A；50～60 min，20%→5%A；60～61 min，5%→85%A；61～80 min，85%A）；柱溫：40 ℃；檢測波長為苯甲酸232 nm，山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯為255 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量10 μL。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖（見圖1 和圖2）。在上述色譜條件下，各待測成分峰與相鄰峰之間分離度良好（各待測成分峰的分離度均＞1.5，理論塔板數均＞50 000），各色譜峰之間無干擾，表明本方法專屬性較好。

圖1 混合對照品（A）、供試品（B）、陰性對照（C）的HPLC圖譜（255 nm）

圖2 混合對照品（A）、供試品（B）、陰性對照（C）的HPLC 圖譜（232 nm）

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.1.1” 項下混合對照品溶液適量，用50%甲醇溶液稀釋得到系列對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣10 μL 測定，記錄峰面積。以對照品濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，6 種成分的回歸方程、相關系數和線性范圍以及所定檢測限、定量限見表1。

表1 6 種成分的回歸方程、相關系數（r）和線性范圍

2.5 精密度試驗

取“2.1.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，連續進樣6 針，記錄各色譜峰的保留時間和峰面積，結果苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯峰面積的RSD 分別為0.66%、0.04%、0.09%、0.07%、0.10%、0.08%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批號小兒止咳糖漿（批號201001）供試品2 mL，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積并測定每份樣品中苯甲酸的含量，結果樣品中苯甲酸含量的RSD 為1.03%（n=6），表明該方法重復性較好。

2.7 穩定性試驗

取同一批號小兒止咳糖漿（批號201001）樣品1 份，精密量取2 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進樣，記錄樣品中苯甲酸的峰面積，測得苯甲酸峰面積值的RSD 為0.91%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取同一批號小兒止咳糖漿（批號201001）樣品1份，精密量取1 mL，共6 份，置100 mL 量瓶中，精密加入濃度分別為0.151 7、0.153 5、0.152 4、0.152 6、0.151 3 mg·mL-1的山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的混合對照品溶液20 mL 和濃度為0.153 7 mg·mL-1的苯甲酸對照品溶液10 mL，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，取續濾液，即得。按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄苯甲酸峰面積，計算回收率，結果見表2。

由表2 可知，6 種防腐劑的平均加樣回收率范圍為98.3%～101.46%，RSD 均＜1%（n=6），表明本方法的準確度較好。

表2 加樣回收率結果（n=6）

2.9 樣品含量測定

取62 個生產廠家提供的79 批小兒止咳糖漿樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積值，計算樣品含量，結果苯甲酸鈉的含量為1.752～2.218 mg·mL-1。

2.10 苯甲酸含量計算

平行稱取兩份2 mg 的苯甲酸對照品置50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋成40 μg·mL-1的苯甲酸對照品溶液，分別進樣3 針，記錄峰面積。

表3 平均校正因子的計算

3 討論

3.1 流動相系統的選擇

參照文獻方法[7]，本實驗考察了甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（pH 4.00）梯度洗脫和甲醇-0.02mol·L-1乙酸銨（pH 3.00）梯度洗脫，結果表明，甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（pH 3.00）作為流動相，峰形和分離度較好且基線平穩，故選擇其作為流動相系統。

3.2 檢測波長的選擇

采用HPLC-DAD 在190～800 nm 波長范圍內進行掃描，結果顯示，苯甲酸的最大吸收波長在232 nm 處，山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯均在255 nm 左右有最大吸收，且峰形及分離度較好。最終選擇232 nm 和255 nm 作為檢測波長。

3.3 色譜柱的選擇

考察了Waters Symmetry ShieldTMRP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）、phenomenex Lunna C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）、ACE ExceL 5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）共4 種色譜柱，通過比對出峰時間、分離度、峰面積、拖尾因子、理論板數等參數，最終選擇了Agilent ZORBAX SB-Aq 型色譜柱。

3.4 含量測定結果分析

由于防腐劑超限會對人身體產生危害[8-10]，同時考慮到小兒止咳糖漿為兒童用藥，兒童身體機能嫩弱，更易受到傷害，安全性應更需重視。因此本實驗建立了HPLC 法測定本品中防腐劑的含量以控制其質量。從測定結果來看，62 個生產廠家提供的79 批次小兒止咳糖漿中均未檢出山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯等處方規定之外的防腐劑。所有廠家的苯甲酸鈉用量均與該藥生產批件一致。除檢出同一生產廠家的兩批次樣品中苯甲酸鈉含量為處方量的一倍外，其余廠家的苯甲酸鈉量均與處方量一致。從檢測結果來看，并綜合考慮實際情況，該產品處方中甘草流浸膏、橙皮酊和桔梗流浸膏有引入防腐劑的風險。建議相關生產廠家提高內控標準來控制該品中苯甲酸鈉等防腐劑的用量。

4 結論

本研究建立HPLC 法測定小兒止咳糖漿中防腐劑的含量，其準確性高、簡便、靈敏，為控制小兒止咳糖漿中防腐劑的含量提供了科學依據。