LC-MS/MS 法測定抗栓膠囊中蟾酥的兩種成分含量*

程 妍，承 晨，薛 平

常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心，常州 213000

抗栓膠囊是由當歸尾、壁虎、水蛭、馬錢子、甘草、骨碎樸、穿山甲、丹參、土鱉蟲、蜂房、人工麝香、土茯苓、烏梢蛇、僵蠶、蜈蚣、地龍、蟾酥、延胡索、虻蟲等19 味中藥組成，可活血化瘀，抗栓通脈。用于治療血栓閉塞性脈管炎瘀血阻絡癥，對腦血栓、心肌梗塞、血栓性靜脈炎等亦有較好的輔助治療作用。

目前，抗栓膠囊主要的質量控制在于顯微鑒別方面[1，2]，包括僵蠶、土鱉蟲、蜈蚣、虻蟲、穿山甲、延胡索和甘草；薄層鑒別方面[3，4]，包括丹參、甘草、當歸尾、馬錢子、土茯苓和骨碎樸；液相色譜鑒別方面，主要為蟾酥。液相色譜檢查方面，主要為馬錢子[5]。液相色譜含量測定為丹參和蟾酥[6]。

蟾酥作為處方中的有效及有毒中藥，多個標準對其含量均進行了控制。目前常用于測定蟾酥中有效有毒成分的方法主要為高效液相色譜法，也有一些使用了液質聯用的檢測手段，選用的指標參數也不盡相同[7-13]。

LC-MS/MS 具有分析速度快、檢測靈敏度高、專屬性強等優點，不需要復雜的前處理過程即可對中藥中多種化學成分進行定性定量分析。本研究采用LC-MS/MS 法，對不同廠家生產的抗栓膠囊中華蟾酥毒基與脂蟾毒配基進行含量測定。

1 材 料

1.1 儀器

液相色譜質譜聯用儀（1290/6470A 安捷倫科技有限公司）；臺式高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；渦旋混合器（上海安譜實驗科技股份有限公司）；超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬分之一分析天平（梅特勒托利多中國公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品：華蟾酥毒基（批號110803-201807，純度99.6%）、脂蟾毒配基（批號110718-201809，純度98.0%），均購自于中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；水為超純水。

抗栓膠囊29 批來源于9 家生產企業。其中安陽A 公司1 批，哈爾濱B 公司11 批，河北C 公司5批，青海D 公司1 批，山西E 公司2 批，山西F 公司2 批，陜西G 公司3 批，陜西H 公司1 批，鄭州I 公司3 批。見表5。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax 300SBC18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫（程序為：0～7 min 60%A，7.5～10.5 min 10%A，11～15 min 60%A）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL·min-1，進樣量：2 μL。

2.1.2 質譜條件 電噴霧（ESI）離子源，正離子掃描模式，監測模式為多反應監測（MRM）。毛細管電壓：3.5 kV；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：6 L·min-1；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11 L·min-1；霧化器壓力：310 kPa。各化合物監測離子對及質譜參數見表1。

表1 離子對及質譜參數

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品儲備液 精密稱取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品各約10 mg，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 混合對照品中間液 精密量取混合對照品儲備液1 mL，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 混合對照品溶液 分別精密量取混合對照品中間液100、200、500 μL，1、2、4 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品儲備液、中間液、對照品溶液濃度信息見表2。

表2 標準儲備液、中間液與對照品溶液濃度

2.2.4 供試品溶液 本品為原粉直接灌裝而成，內容物即為粉末。取供試品粉末，混合均勻，取0.25 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，精密加入甲醇25 mL，密塞，渦旋混勻，超聲處理20 min，8000 r·min-1離心6 min，上清液濾過，即得。

2.2.5 空白基質溶液 空白基質樣品為缺蟾酥的抗栓膠囊陰性樣品，來源于生產廠家。按“2.2.4”供試品溶液的制備方法處理，制成空白基質溶液。

2.3 專屬性考察

取“2.2.3”項下標準曲線第4 個濃度點（1 mL 配制液）作為對照品溶液。另取缺蟾酥陰性樣品適量，按“2.2.4”項下方法制備陰性對照溶液。

取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，分別進樣，記錄色譜圖，見圖1。結果表明，陰性基質對主成分測定無干擾，專屬性良好。

圖1 LC-MS/MS 圖

2.4 線性關系考察

取“2.2.3”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分濃度（ng·mL-1）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，各成分在各自濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。以3 倍信噪比和10 倍信噪比確定化合物在樣品基質中的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。線性關系等見表3。

表3 線性關系與檢出限、定量限

2.5 進樣精密度試驗

取“2.2.3”項下第4 個濃度點的對照品溶液之華蟾酥毒基濃度為108.860ng·mL-1，脂蟾毒配基濃度為108.560 ng·mL-1，按“2.1”項下色譜與質譜條件測定，連續進樣6 次，根據測得值計算RSD，結果見表4，表明儀器精密度良好。

表4 精密度、重復性與加樣回收率（n=6）

2.6 重復性試驗

取同一批樣品（哈爾濱B 公司，批號201102，編號10），按“2.2.4”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，根據峰面積測得值，帶入線性回歸方程，計算出待測組分的濃度，再根據樣品稀釋倍數及稱樣量，計算得出樣品中待測組分的含量（μg·g-1），計算RSD，結果見表4，表明方法的重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取同一批已知含量的樣品（哈爾濱B 公司，批號201102，編號10）約0.1 g，精密稱定，精密加入對照品中間液1mL，按“2.2.4”項下方法平行制備，按“2.1” 項下色譜與質譜條件測定，根據峰面積測得值，帶入線性回歸方程，計算出待測組分的濃度，再根據樣品稀釋倍數及稱樣量，計算得出加樣樣品中待測組分的含量（μg），計算回收率，結果見表4，表明該方法的準確度符合測定要求。

2.8 樣品含量測定

精密稱取不同廠家不同批號的抗栓膠囊，按“2.2.4”項下方法平行制備4 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，根據抗栓膠囊的平均裝量，計算得出29 批樣品的含量（μg·粒-1）。結果見表5。

表5 29 批樣品信息及其2 種成分含量測定結果（n=4）

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

傳統HPLC 法測定蟾酥兩種成分，儀器分析時間一般45～80 min，樣品經提取后需濃縮5～10 倍，檢測濃度為微克級。本實驗采用LC-MS/MS 法，梯度洗脫，分析時間縮短為15 min；樣品經過超聲提取后，直接稀釋進樣，簡化了樣品前處理過程；檢測濃度為納克級，適合中藥制劑中含量低、不易分離的化學成分的測定。

本研究前期參照了蟾酥含量測定的相關標準方法進行樣品處理，并用高效液相色譜法進行測定。從液相圖譜中顯示，色譜峰較多又雜，主要指標成分與其他色譜峰未有較好分離，故采用LC-MS/MS 法對蟾酥中華蟾酥毒基與脂蟾毒配基進行含量測定。

3.2 色譜-質譜條件的確定

本研究考察了不同色譜柱的分離效果，結果顯示，不同色譜柱分離效果未有明顯差異，故選用常規Agilent ZORBAX 300SB-C18色譜柱。質譜條件中考察了離子監測模式，由于這兩種成分均為酯類物質，易得到質子，故采用正離子模式。試驗中流動相中加入適量甲酸，在正離子模式下響應高，峰形佳。

3.3 兩成分含量結果分析

本研究參考《中國藥典》2015、2020 版，抗栓膠囊已有國家標準及蟾酥成分研究已有相關文獻，故選擇華蟾酥毒基與脂蟾毒配基兩種成分作為抗栓膠囊的指標成分。由測定結果可知，抗栓膠囊樣品均含有華蟾酥毒基與脂蟾毒配基，但不同廠家不同批次的抗栓膠囊差異十分明顯，除哈爾濱B 公司外的其他廠家因抽驗批數較少缺乏統計學意義。哈爾濱B 公司樣品共涉及11 個批號，不同批號間RSD為6.5%左右，含量區間為5.3 μg·粒-1～6.7 μg·粒-1。有部分廠家測得的華蟾酥毒基和脂蟾毒配基總量極低，且批間數據差異較大，因蟾酥在該品處方中配比較低，可能存在生產配制過程中混合不均或損耗等情況，這可能會對臨床療效產生較大差異，故考慮根據《中國藥典》蟾酥中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基總量及抗栓膠囊處方中各藥味比例進行蟾酥含量折算并擬定限度（因是原粉入藥，轉移率以70%計），從而用一個統一的指標評價市場上抗栓膠囊的質量。由此作為指標成分之一，對之后建立抗栓膠囊質量控制的國家標準、評價抗栓膠囊質量有一定的指導意義。

本研究建立了定量測定抗栓膠囊中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的LC-MS/MS 法，結果顯示，該方法操作簡單、檢測快速、靈敏度高、重復性好，可用于抗栓膠囊的質量控制。