生血方的鑒別與含量測定

郭懷宇，陳金鋒，謝俊杰，郁冬冬，姜 蕾

六安市中醫院 藥劑科，安徽六安 237001

生血方是六安市中醫院生產的醫院制劑穴位貼，處方由黃芪、女貞子、當歸、炒白術、茯苓、菟絲子、枸杞子等10 味中藥組成，具有補腎、活血的功效。該方聯合他藥常規治療宮頸癌和胃癌等疾病，經臨床驗證，臨床效果理想[1，2]。黃芪中含有皂苷、黃酮、氨基酸等成分。其中，皂苷類成分具有抗癌等藥理作用[3，4]；黃酮類成分具有抗缺血和改善血相作用[5，6]。女貞子中含有三萜、黃酮、多糖類成分，具有抗腫瘤、調節免疫等作用[7]。當歸中含有揮發油和有機酸等成分，具有補血、促進免疫等作用[8]。馬靖、孟楣等采用高效液相-蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）測定黃芪中的黃酮類成分和皂苷類成分[9，10]。本研究通過黃芪等薄層色譜鑒別以及高效液相色譜法（HPLCELSD），建立了黃芪甲甘和芒柄花素的含量測定，用于控制該制劑的質量。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀（含奧泰ELSD 6000 蒸發光檢測器、CSChormPlus 工作站），美國安捷倫公司；BT125D 型電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；KQ-5200DA 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪甲苷對照品（批號：110781-201717）、芒柄花素對照品（批號：111703-201504），女貞子對照藥材（批號：121041-201404）、阿魏酸對照品（批號：121137-201606）均購于中國食品藥品檢定研究院；生血方（3 批：批號：20180521、20180618、20180713），六安市中醫院制劑室自制。乙腈為色譜純；其他試劑為分析醇；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 黃芪薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取本品6g，研細，加甲醇100mL，超聲處理30 分鐘，濾過，濾液蒸干，固體物加水20mL 使溶解，用水飽和正丁醇提取4 次（40mL/次），合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次（40 mL/次），棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，固體物加適量甲醇溶解，定容至1 mL，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液制備 取缺黃芪藥材，根據制劑工藝制成相應陰性對照，按“2.1.1”項下方法制備，即得。

2.1.4 鑒別方法 吸取供試品、對照品，陰性對照溶液各5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶7∶2）的下層溶液（10 ℃以下分層靜置30 分鐘以上）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱約5 分鐘，結果見圖1A。由圖1A 可知，供試品色譜與對照品色譜相應的位置顯相同顏色斑點，陰性無干擾。

2.2 女貞子薄層色譜鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品粉末2 g，加稀乙醇50 mL，超聲處理30 分鐘，濾過，濾液即為供試品溶液。

2.2.2 對照藥材溶液的制備 取女貞子對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 取缺女貞子各藥材，根據制劑工藝制成相應陰性對照，按“2.2.1”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.4 鑒別方法 吸取供試品、對照藥材、陰性對照溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ℃～60 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置碘蒸氣中熏至斑點清晰，置日光下檢視，結果見圖1B。由圖1B 可知，供試品色譜與對照藥材色譜相應的位置顯相同顏色斑點，陰性無干擾。

2.3 當歸的薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取本品粉末6 g，加1%碳酸氫鈉溶液50mL，超聲處理10 分鐘，離心，取上清液用稀鹽酸調節pH 值至2～3，用乙醚振搖提取2 次，每次20mL，合并乙醚液，揮干，固體物加甲醇1mL 使溶解，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg 的溶液，即得。

2.3.3 陰性對照溶液制備 取缺當歸各藥材，根據制劑工藝制成相應陰性對照，按“2.3.1”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3.4 鑒別方法 吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（1∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖1C。由圖1C 可知，供試品色譜與對照品色譜相應的位置顯相同顏色斑點，陰性無干擾。

圖1 生血方中的薄層鑒別

2.4 黃芪甲苷和芒柄花素含量測定

2.4.1 溶液制備

2.4.1.1 對照品溶液 精密稱取黃芪甲苷、芒柄花素對照品適量，加甲醇制成每毫升含黃芪甲苷1.326 mg、芒柄花素0.894 mg 的的混合對照品溶液，搖勻即得。

2.4.1.2 供試品溶液 取生血方粉末約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，加2%氫氧化鉀甲醇溶液100 mL，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 分鐘，濾過，濾液蒸干，固體物加水10 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇提取4 次（30 mL/次），合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次（3 mL/次），棄去氨試液，正丁醇液蒸干，固體物加水5 mL 溶解，過D101 型大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，長12 cm），以50 mL 水洗脫，棄去洗脫液，再用40%乙醇30 mL 洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，固體物加甲醇溶解并轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.1.3 陰性對照溶液 取缺黃芪陰性樣品，按照“2.4.1.2”項下方法制備缺黃芪的陰性對照溶液。

2.4.2 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-水（34:66），流速為1mL·min-1，柱溫為30 ℃；蒸發光散射檢測器漂移管溫度為100 ℃，載氣為空氣，載氣流量為2.6 L·min-1，進樣量為20 μL。

在上述色譜條件下，黃芪甲苷和芒柄花素的色譜峰分離比較理想，分離度＞1.5，理論塔板數以黃芪甲苷和芒柄花素計算分別為14166 和23835，且陰性無干擾。對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖2。

圖2 對照品（A）、樣品（B）、黃芪陰性樣品（C）的HPLC 色譜圖

2.4.3 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.4.2”項下色譜條件進樣20 μL 測定。以進樣量的對數和對應峰面積對數得到回歸方程，結果見表1。

表1 回歸方程和線性范圍

2.4.4 進樣精密度試驗 取同一混合對照品溶液，連續進樣6 次，計算峰面積，結果黃芪甲苷和芒柄花素峰面積的RSD 分別為1.6%和1.4%。表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，測得黃芪甲苷和芒柄花素峰面積的RSD 分別為0.2%和0.9%，表明樣品溶液24 h 內穩定性較好。

2.4.6 耐用性試驗 選用3 種不同品牌的色譜柱[色譜柱1：Agilent Zorbax SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;色譜柱2：依利特Hypersil ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），色譜柱3：Unitary C8色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）]，分別取“2.4.1.2”項下的供試品溶液，按“2.4.2”項下的色譜條件進樣檢測，均能達到系統適用性試驗要求。

2.4.7 重復性試驗 取同一批號生血方樣品適量，共6 份，分別按“2.4.1.2”項下方法制備供試品溶液，連續進樣，記錄黃芪甲苷和芒柄花素峰面積，根據外標法，計算6 份樣品中各自所含的黃芪甲苷和芒柄花素的含量，測得黃芪甲苷和芒柄花素的含量分別為0.683 mg·g-1和0.477 mg·g-1，RSD 分別為0.3%和1.1%。表明該方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取已知含量的生血方9份，每份1.5g，精密稱定，按“2.4.1.2”項下方法制備供試液，精密加入低、中、高混合對照品溶液，平行制備9 份樣品，按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，記錄黃芪甲苷和芒柄花素的峰面積，根據外標法計算平均加樣回收率，結果見表2。

表2 回收率試驗結果（n=9）

黃芪甲苷和芒柄花素的回收率分別在97.7%～100.1%和97.7%～98.8%，其平均回收率分別為99.1%和98.5%，RSD 分別為0.7%和0.3%。表明該方法的回收率符合要求。

2.4.9 樣品含量測定 分別取3 個批號生血方樣品適量，按“2.4.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，記錄黃芪甲苷和芒柄花素的峰面積，由回歸方程計算樣品中黃芪甲苷和芒柄花素的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果

3 討論

本試驗分別對甲醇/水，乙腈/水兩個流動相系統進行考察，得出乙腈/水為系統的流動相分離效果較為理想，供試品溶液中2 個成分有較好的峰形且能完全分離，溶劑噪音水平較低，所得圖譜較理想。

生血方是由10 味中藥組成，本實驗除了對生血方中黃芪、女貞子、當歸進行定性鑒定，以及對黃芪甲苷、芒柄花素2 種成分進行定量測定外，還針對黃精、山藥等其余7 種中藥進行了薄層鑒別，嘗試不同極性展開系統和顯色劑的效用，均未能獲得滿意結果，存在未見相同特征斑點、陰性樣品干擾等問題，故未將該部分納入質控研究中。

黃芪中的活性成分黃芪甲苷為皂苷類，芒柄花素為黃酮類，本試驗通過建立HPLC-ELSD 法同時檢測2 個成分含量的方法，為控制生血方質量提供了試驗基礎。