基于HPLC 指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析不同炮制方式對(duì)九制女貞子化學(xué)成分的影響*

姜譽(yù)弘，姚 毅，劉史佳，劉志輝，任 娟，俞 凡，龐會(huì)明

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院 藥學(xué)部，南京 210029

女貞子（Ligustri Lucidi Fructus）為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，女貞子含有三萜類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、多糖類、揮發(fā)油、脂肪酸、氨基酸和各種微量元素等[2-5]。現(xiàn)代藥理研究表明，女貞子具有抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、調(diào)血脂等多種藥理作用[2，4]。在《本草述校注》[5]中記載“女貞實(shí)一斗，如法去皮，每斗用馬料黑豆一斗。揀凈淘洗，同蒸透，九蒸九曬蒸女貞實(shí)，先將上好老酒浸一宿，次日用黑豆蒸，如此者九，以其性寒故也”，即九制后的女貞子可去除其寒性，用于各類制劑中，例如，本院特色制劑延年益壽丹，具有滋補(bǔ)肝腎、固本培元的功效，其中4 味中藥需要九蒸九曬，女貞子就是其中之一。

九蒸九曬法以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，具體是根據(jù)藥材自身性質(zhì)的需要而采取一系列加工處理技術(shù)[6]。中藥經(jīng)過九制后主要改變可歸納為三類：①可以改變藥性。例如地黃[7]炮制后性轉(zhuǎn)溫，功效由清轉(zhuǎn)補(bǔ)，以滋陰補(bǔ)血為主。②增加療效。例如黃精[8]增其厚重之氣，克其濕膩之性，強(qiáng)其補(bǔ)益之效。③降低毒性。例如何首烏[9]九制后游離蒽醌含量增加，二苯乙烯苷含量降低。九蒸九曬法因受限于氣候、溫度、濕度及制藥周期長(zhǎng)、藥材因未及時(shí)曬干而發(fā)霉變質(zhì)等，無奈被棄用。因此本研究提出用九蒸九烘法代替九蒸九曬法，通過對(duì)兩種干燥工藝下女貞子性狀、浸出物和化學(xué)成分變化的比較，為后續(xù)九制女貞子大生產(chǎn)和分析鑒定提供理論基礎(chǔ)，讓特色制劑造福民眾。

1 儀器與藥品、試劑

e2695 高效液相色譜色譜儀（含2998 型PDA 檢測(cè)器，Empower 工作站，美國(guó)Waters 公司）；BP211D十萬分之一電子天平（賽多利斯公司）；SK6200H 超聲清洗機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；CT-C-11熱風(fēng)循環(huán)烘箱（杭州金竺機(jī)械有限公司）。

18 批女貞子生品飲片產(chǎn)地分別為湖南（S1～S6）、貴州（S7～S12）、江蘇（S13～S18），經(jīng)江蘇省中醫(yī)院劉志輝主任中藥師鑒定確認(rèn)。酒蒸女貞子按照《中國(guó)藥典》2020 版女貞子項(xiàng)下的炮制方法制備。

對(duì)照品：女貞苷（批號(hào)：P26D9F78576）、橄欖苦苷（批號(hào)：P02M11L109137）、紅景天苷（批號(hào)：N26A11X111127）、新女貞苷（批號(hào)：S01O11D126 004）、特女貞苷（批號(hào)：P02D11L133055）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；木犀草苷（批號(hào)：111720-201810）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：111530-201914）、松果菊苷（批號(hào)：111670-201907）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 女貞子炮制品的制備

取湖南（S1）、貴州（S7）和江蘇（S13）3 個(gè)產(chǎn)地女貞子生品，按下述方法進(jìn)行九蒸九曬和九蒸九烘：

曬干炮制品 取女貞子10 kg 加2 kg 黃酒拌勻，置于蒸鍋中蒸10 h 至無白心，陽光下自然曬干，取500 g 留樣。復(fù)蒸10 h，陽光下自然曬干，如此重復(fù)8 次，每蒸曬1 次，分別取500 g 留樣，即得女貞子九蒸九曬成品。

烘干炮制品 取女貞子10 kg 加2 kg 黃酒拌勻，置于蒸鍋中蒸10 h 至無白心，60 ℃烘干，取500 g留樣。復(fù)蒸10 h，60 ℃烘干，如此重復(fù)8 次，每蒸曬1次，分別取500 g 留樣，即得女貞子九蒸九烘成品。

炮制后，本品形如女貞子，表面黑褐色或灰黑色，常附有白色粉霜，微有酒香氣。經(jīng)九蒸九曬和九蒸九烘工藝，飲片的整體顏色由棕褐色轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚姿饾u減少。第9 次炮制后，女貞子表面有明顯光澤，具黏性。兩種干燥工藝的飲片外觀性狀無顯著差異，見圖1。

圖1 女貞子炮制品

2.2 女貞子不同炮制程度的浸出物測(cè)定

按照《中國(guó)藥典》2020 版“醇溶性浸出物測(cè)定法”（通則2201）項(xiàng)下的熱浸法，取本品粉末（過2 號(hào)篩）約4 g，精密稱定，置250 mL 的錐形瓶中，加30%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h 后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定重量。

除另有規(guī)定外，以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）。結(jié)果見表1 和圖2。

圖2 醇溶性浸出物結(jié)果

表1 女貞子醇溶性浸出物結(jié)果（%）

在九蒸九曬和九蒸九烘過程中，醇溶性浸出物整體呈逐漸下降趨勢(shì)，但第9 次炮制后，曬干品和烘干品的浸出物含量均明顯上升；與生品比較，炮制品的浸出物含量稍有降低；與第9 次曬干品比較，第9次烘干品浸出物含量稍微減少，但無顯著差異。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取女貞苷、橄欖苦苷、紅景天苷、新女貞苷、特女貞苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷對(duì)照品適量，加甲醇配制得到濃度分別為1.087、0.691、1.056、0.956、1.100、149.300、150.000、1.056 mg·mL-1的各對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取女貞子粉末（過3 號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇30 mL，稱定重量，超聲處理（功率480 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6mm×100mm，2.7μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（梯度洗脫：0～25 min，5%～13%B；25～40 min，13%B；40～85 min，13%～35%B；85～100 min，35%～90%B）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一批女貞子生品飲片（江蘇S13），按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)6 次，記錄色譜圖。以特女貞苷峰（20 號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積作為參照，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均＜5%，表明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批女貞子生品飲片（江蘇S13），按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以特女貞苷峰（20 號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積作為參照，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均＜5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批女貞子生品飲片（江蘇S13），按照“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按照“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以特女貞苷峰（20 號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積作為參照，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均＜5%，表明方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的要求。

2.7 女貞子生品指紋圖譜建立和相似度評(píng)價(jià)

按照“2.4”項(xiàng)下方法制備18 批女貞子生品供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將得到18 批女貞子測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723 版）》進(jìn)行分析，設(shè)置S1 為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，經(jīng)過多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，該圖譜作為女貞子生品的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，圖譜中共確定26 個(gè)共有峰，結(jié)果見圖3。

將18 批女貞子樣品與對(duì)照指紋圖譜匹配，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果各批次女貞子生品與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度在0.880～0.999，表明各批次之間一致性較好。本方法可用于綜合評(píng)價(jià)女貞子樣品。

2.8 共有峰的歸屬

女貞子生品檢出26 個(gè)色譜峰，歸屬8 個(gè)色譜峰，見圖3。

圖3 18 批女貞子生品HPLC 指紋圖譜（A）及其共有模式（B）

2.9 女貞子不同炮制品HPLC 指紋圖譜色譜峰的歸屬與比較

按照“2.4”項(xiàng)下方法制備女貞子九蒸九曬和九蒸九烘供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以湖南為例，結(jié)果見圖4。記錄各色譜峰峰面積，計(jì)算第9 次曬干品和第9 次烘干品各色譜峰的單位質(zhì)量（g）峰面積（A），結(jié)果見表2。根據(jù)已知對(duì)照品的保留時(shí)間對(duì)炮制品中的色譜峰進(jìn)行歸屬。

表2 女貞子第9 次曬干和第9 次烘干炮制品的色譜峰比較

圖4 女貞子生品及不同炮制程度的HPLC 指紋圖譜（湖南）

結(jié)合色譜圖結(jié)果和峰面積比值，進(jìn)行分析：1、4（紅景天苷）、5、6、7、8、22 號(hào)峰在炮制過程中均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)；9、13（松果菊苷）、15（木犀草苷）、18（毛蕊花糖苷）、19（女貞苷）、20（特女貞苷）、23 和25 號(hào)峰在炮制過程中均依次降低；2、3、11、12、14、16（新女貞苷）、17、21（橄欖苦苷）和24 號(hào)峰在炮制過程中峰面積逐漸降低直至消失；10 和26 號(hào)峰，考慮存在誤差因素，可視為不變。

新成分a 在第1 次炮制后顯著生成，且在后續(xù)炮制過程中逐漸增加，九蒸九曬和九蒸九烘增加程度無顯著差異；新成分b 在炮制過程中呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)；新成分c 在炮制過程中呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，九蒸九曬和九蒸九烘工藝結(jié)果無顯著差異。

2.10 聚類分析

以生品女貞子和第9 次炮制品共有峰的相對(duì)峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析。Z 標(biāo)準(zhǔn)化后采用瓦爾德法，以平方歐式距離作為樣品相似度的距離公式，結(jié)果見圖5。聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)平方歐式距離為5～10 時(shí)，樣品可分為3類：貴州、江蘇和湖南生品聚為一類；湖南第9 次曬干和湖南第9 次烘干聚為一類；貴州第9 次曬干和烘干、江蘇第9 次曬干和烘干聚為一類。表明女貞子曬干和烘干兩種干燥工藝均聚為一類，無差異。

圖5 女貞子生品和炮制品聚類分析

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)女貞子樣品進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，參照文獻(xiàn)[10,11]并比較了230、240、280 nm 波長(zhǎng)下，女貞子樣品中色譜峰的歸屬，表明在240 nm 波長(zhǎng)下生品和炮制品的色譜峰最多，響應(yīng)最強(qiáng)，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 溶劑的選擇

本試驗(yàn)分別考察了50%乙醇與70%乙醇、50%甲醇與70%甲醇作為樣品溶劑，進(jìn)行超聲提取，結(jié)果表明，當(dāng)70%甲醇作為溶劑提取時(shí)，女貞子樣品的色譜峰最多，響應(yīng)也最強(qiáng)，提取最完全，因此選擇70%甲醇作為樣品的溶劑。

3.3 流動(dòng)相的選擇

參照文獻(xiàn)[10，11]報(bào)道，本試驗(yàn)分別對(duì)水-乙腈、0.2%磷酸水-乙腈和0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，各流動(dòng)相條件下，色譜峰的出峰時(shí)間相差不大；但是在0.1%甲酸-乙腈的流動(dòng)相系統(tǒng)下，色譜峰的分離度和峰型較好，顯著改善了其他流動(dòng)相系統(tǒng)中出現(xiàn)的拖尾、肩峰等問題。

本試驗(yàn)首先通過高效液相色譜法建立了女貞子生品的指紋圖譜，包括了18 個(gè)批次女貞子來自3個(gè)產(chǎn)地，對(duì)女貞子中各成分進(jìn)行初步歸屬與分析。參照《中國(guó)藥典》和文獻(xiàn)報(bào)道的工藝條件，對(duì)女貞子進(jìn)行九蒸九曬和九蒸九烘的炮制工藝，并考察了炮制過程中醇溶性浸出物的變化，結(jié)果表明，九蒸九曬和九蒸九烘工藝無顯著差異。

本試驗(yàn)通過指紋圖譜結(jié)果，系統(tǒng)地分析了女貞子從一蒸一曬（烘）到九蒸九曬（烘）全過程，在檢出的26 個(gè)色譜峰中，有7 個(gè)色譜峰呈現(xiàn)含量增加的趨勢(shì)（紅景天苷等），17 個(gè)色譜峰呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)（9 個(gè)色譜峰在九制后的成品中消失），2 個(gè)色譜峰在整個(gè)炮制過程中呈現(xiàn)不變化的特征。新成分a、b、c 在炮制過程中均逐漸增加，根據(jù)其出峰時(shí)間、前后化合物的指認(rèn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12，13]，推測(cè)新成分a 和b 可能為醛類和苯乙醇類；新成分c 可能為環(huán)烯醚萜苷類。結(jié)合HCA 結(jié)果分析，兩種炮制工藝無顯著差異，無論是浸出物結(jié)果還是化學(xué)成分的變化和程度均呈現(xiàn)一致性，可考慮用九蒸九烘的工藝代替?zhèn)鹘y(tǒng)九蒸九曬工藝，以避免大生產(chǎn)中出現(xiàn)因生產(chǎn)周期長(zhǎng)、飲片發(fā)霉變質(zhì)等問題。