肝細胞生長因子基因轉染對骨質疏松骨愈合的影響及其作用機制

史凡祺，甄瑞鑫，鄭鑫，劉世全，王媛媛

(承德醫學院附屬醫院，1.微創脊柱外科；2.胃腸外科；3.胸外科；4.承德中心醫院眼科，河北 承德 067000)

骨質疏松為絕經后女性群體常見代謝性疾病之一，主要表現為骨組織微結構損傷、易骨折、骨量下降以及骨脆性上升等[1]。骨折后所致長時間臥床較易造成一系列并發癥發生，嚴重影響患者生活質量，嚴重者甚至威脅生活安全[1-2]。目前研究[3-4]顯示，血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子等細胞外信號分子可明顯加快骨骼再生以及骨愈合進程。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種刺激肝細胞增殖物質，作為細胞外信號分子主要由間充質細胞分泌，可介導上皮-間充質相互作用[5]。HGF促有絲分裂作用可經由旁分泌與自分泌過程加速肌肉吸收與利用，發揮組織修復作用[6-7]。HGF可通過調節骨形態發生蛋白-2介導的核因子-κB信號通路促進骨再生而治療骨折[8-9]。為明確HGF在骨愈合過程中作用及影響機制，本研究擬選擇骨質疏松性骨折大鼠模型進行HGF基因轉染。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑及材料

健康雌性C57BL/6J大鼠(廣東至遠生物醫藥科技有限公司；SYXK(粵)2021-0251)，周齡為8周，體質量(19.26±2.76)g，飼養環境溫度為22～24 ℃與相對濕度52%～58%。DMEM/F12培養基購自Gibco，青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶購自Hyclone，FuGENE HD Transfection Reagent購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司，DNA質粒購自和元生物技術(上海)股份有限公司，熒光實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR)引物及試劑購自Takare公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗儀器

細胞培養箱購自上海富澤商貿有限公司，雙能X線骨密度測量儀購自阿斯邁德生物科技(北京)有限公司，微型計算機斷層掃描(μCT)儀購自瑞士Scanco Medical AG公司，萬能力學測試機購自日本島津公司，PCR儀購自瑞士Roche公司，離心機購自力康生物醫療科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨髓間充質干細胞(BMSCs)分離與培養 選擇1只雌性健康SD大鼠以頸椎脫臼法將其處死，在無菌環境下收集大鼠脛骨與股骨，無菌磷酸鹽緩沖溶液沖洗以保證骨表面軟組織被完全清除，脛骨與股骨兩端采用咬骨鉗咬除，骨髓腔采用DMEM/F12培養基多次沖洗至髓腔發白，細胞懸液經多次吹打后以200目篩網過濾，過濾后收集細胞懸液，懸液經離心處理后再次重懸，以1.0×104個/mL接種至培養瓶，轉移到細胞培養箱(37 ℃、5% CO2)中培養，培養48 h進行半換液，72 h予以全換液，其后換液頻率為2 d。每天均需要在顯微鏡下觀察細胞生長情況，至生長到瓶底面積的80%時需要以1∶3比例進行傳代。

1.3.2 HGF慢病毒載體構建及轉染 轉染前1 d，BMSCs細胞需要以0.5×105個/mL轉移至24孔板，應用無抗生素培養基培養1 d，保證轉染前細胞融合率達至80%～90%。50 mL無血清DMEM/F12培養基中加入DNA質粒后勻混，再取50 mL無血清DMEM/F12培養基加入適量FuGENE HD Transfection Reagent混勻后在室溫環境下孵育5 min，孵育結束后將兩種無血清DMEM/F12培養基輕輕混合均勻，在室溫環境下孵育25 min，24孔板中每孔添加上述混合物100 μL與適當體積培養基。細胞在加入混合物4～6 h后換液，再次培養18～48 h后應用顯微鏡觀察細胞轉染情況，并在72 h后收集最高轉染效率細胞，調整細胞濃度至1.0×106個/μL進行后續研究。

1.3.3 骨質疏松骨折模型大鼠構建及分組 選擇100只健康雌性SD大鼠，隨機取其中80只構建骨質疏松模型大鼠，大鼠稱重后采用以10 mg/kg劑量1%戊巴比妥鈉進行麻醉處理，大鼠固定在操作臺上，消毒鋪巾后將皮膚、肌肉逐層切開，打開腹腔，沿著子宮方向向上尋找卵巢，結扎后將其切除，無菌生理鹽水沖洗處理后將腹腔關閉，術后3 d內均采用青霉素鈉處理以預防感染。另20只作為假手術組(Sham組)需切除等量脂肪，不切除卵巢。造模后大鼠單籠飼養于同一房間，環境、攝食以及飲水情況均相同，3個月后測定大鼠骨密度以判斷大鼠是否建模成功。骨質疏松大鼠最終建模成功76只，隨機分為四組，分別為模型組(Model組)、BMSCs組、空載慢病毒組(Vehicle組)與HGF慢病毒組(Vehicle+HGF組)，每組均為19只。上述四組大鼠均以1%戊巴比妥鈉麻醉后使左側脛骨顯露，于其上端1/2位置將脛骨剪斷形成骨折，骨折后以克氏針髓內固定。大鼠BMSCs組、Vehicle組與Vehicle+HGF組，分別以1.0×106個/kg注入BMSCs、空載慢病毒-BMSCs、HGF慢病毒-BMSCs，而Sham組與Model組則注入等量生理鹽水，各組在相同飼養條件下再次飼養1個月。

1.3.4 大鼠骨折愈合程度與骨密度測定 大鼠飼養結束后隨機取5只應用X線側位片及雙能骨密度測定儀分別評估左側脛骨骨折愈合情況與骨密度，骨折愈合程度按照X線結果進行評分[10]，評分由3位影像科醫師負責，最終骨折愈合評分結果為3位醫師評估結果均值。

1.3.5 大鼠骨痂骨參數測定 取5只大鼠再全麻條件下穿刺心臟處理，收集左側脛骨骨折標本。將收集大鼠脛骨骨折標本切成含有全部骨痂的塊狀物，其大小為10 mm，置于70%酒精中保存，采用micro-CT系統測定定量評估標本骨參數，主要包括骨痂感興趣區平均斷面面積、相對骨體積及百分比骨體積。

1.3.6 骨痂組織中骨愈合相關因子水平測定 取4只大鼠在全麻條件下穿刺心臟處理，收集左側脛骨骨折標本，取骨折愈合位置組織，應用RNA提取試劑盒與反轉錄試劑盒獲得cDNA，采用熒光實時qPCR測定骨痂組織中骨愈合相關因子骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(OCN)、轉錄因子抗體(OSX)、Runt相關轉錄因子2(Runx2)、基質金屬蛋白酶13(MMP-13)等指標mRNA水平，依據Maxima SYBR Green qPCR Mastermix試劑盒說明書選擇各反應物用量，反應條件設置為：95 ℃、95 ℃、60 ℃、72 ℃環境下分別預變性處理5 min、變性處理15 s、退火處理20 s、延伸處理30 s，共需要循環45次。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 五組大鼠骨折愈合程度評分與骨密度比較

Model組骨折愈合程度評分與骨密度低于Sham組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組與Vehicle+HGF組骨折愈合程度評分與骨密度均高于Model組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組骨折愈合程度評分及骨密度比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；Vehicle+HGF組骨折愈合程度評分與骨密度高于BMSCs組、Vehicle組(P<0.05)。見表2。

表2 五組大鼠骨折愈合程度評分與骨密度比較

2.2 五組大鼠骨痂骨參數比較

Model組平均斷面面積、相對骨體積高于Sham組，百分比骨體積低于Sham組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組與Vehicle+HGF組平均斷面面積、相對骨體積低于Model組，百分比骨體積高于Model組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組平均斷面面積、相對骨體積及百分比骨體積比較，差異無統計學意義(P>0.05)；Vehicle+HGF組平均斷面面積、相對骨體積低于BMSCs組、Vehicle組，百分比骨體積高于BMSCs組、Vehicle組(P<0.05)。見表3。

表3 五組大鼠骨痂骨參數比較

2.3 五組骨痂組織中骨愈合相關因子水平比較

Model組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA低于Sham組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組、Vehicle+HGF組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA高于Model組(P<0.05)；BMSCs組、Vehicle組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA比較，差異無統計學意義(P>0.05)，Vehicle+HGF組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA高于BMSCs組、Vehicle組(P<0.05)。見表4。

表4 五組骨痂組織中骨愈合相關因子水平比較

3 討論

大鼠骨質疏松性骨折采用骨保護素基因修飾BMSCs處理后可顯著抑制破骨細胞活性，保證大鼠骨代謝平衡，進而改善大鼠骨密度，顯示基因治療改善骨質疏松性大鼠骨代謝情況的療效明確[11]。HGF為骨髓微環境細胞分泌重要生長因子，不僅可以在體內與體外介導成骨細胞增殖分化過程，還能夠調節骨吸收以及新生過程[12]。BMSCs作為多向分化細胞，可在骨組織修復及再生方面發揮重要作用。既往研究[13-14]已證實，BMSC向成骨分化過程是骨質疏松性骨折愈合重要機制，因此本研究選擇BMSCs作為HGF基因表達載體，以促進骨質疏松性骨折骨愈合。

骨愈合過程是一個應對骨損傷發生多階段復雜修復過程，使損傷骨生物力學以及骨功能狀態恢復正常是其最終目標[4]。骨質疏松性骨折愈合需要經歷炎癥期、軟骨內骨化期以及骨痂重塑期三個階段，軟骨內成骨階段是骨愈合重要階段，可多向分化MSCs并促使其被大量聚集在骨折斷端，然后在生長因子作用下分化成軟骨細胞，分泌出大量軟骨蛋白聚糖以及X型膠原以促進骨折位置形成軟骨骨痂，隨后成骨細胞侵入并進行分化，在骨基質分泌后使小梁骨礦化，最終形成骨性骨痂以使其斷端連接[15-16]。軟骨內骨化過程由BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13等多種因子調節，其中，MMP-13是軟骨細胞降解標志物，BALP、OCN、OSX、Runx2可反映成骨分化及礦化能力[17-18]。本研究中，相對于Sham組，Model組BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13 mRNA等指標均明顯下降，而HGF慢病毒轉染則有效改善骨質疏松性骨折大鼠上述指標下降狀態，顯示HGF慢病毒轉染可促進新骨形成，加速骨折組織軟骨內骨化過程，這對于加快骨折愈合具有積極意義。國外研究者[19]也發現，在小鼠骨折模型中，HGF處理可調節成骨細胞和破骨細胞活力，發揮較顯著的平衡成骨細胞和破骨細胞的比例作用，上調小鼠成骨細胞中p65、IκB激酶β和IκBα的表達，同時促進血管內皮生長因子、BMP-2受體、NF-κB配體受體激活劑和巨噬細胞集落刺激因子表達，表明HGF參與骨再生、血管生成以及成骨細胞和破骨細胞之間平衡。本研究對骨痂骨參數分析顯示，HGF慢病毒轉染可以有效改善骨痂骨參數，證實HGF慢病毒轉染可以促進骨重塑和損傷骨組織形成致密新骨橋以連接骨折位置，改善骨痂力學性能，改善骨折愈合程度。另一項研究[20]顯示HGF修飾牙髓來源的骨髓間充質干細胞可高度表達成骨相關基因，具有較強的成骨分化能力，還可顯著減少卵巢摘除術構建骨質疏松模型大鼠股骨遠端干骺端小梁骨骨丟失，表明采用HGF修飾牙髓來源的骨髓間充質干細胞可以有效減輕骨質疏松大鼠骨損傷，這與本研究中HGF基因轉染可以促進骨質疏松性骨折大鼠骨愈合、改善大鼠骨密度結論類似。

綜上，HGF基因轉染可上調BALP、OCN、OSX、Runx2、MMP-13等骨愈合相關指標水平，促進骨重塑以及軟骨內成骨形成，改善骨生物力學性能，進而促進骨質疏松性骨折大鼠骨愈合，可為骨質疏松性骨折治療提供新思路。