異秦皮素治療腦梗死大鼠的療效觀察及機制研究

陳歷，季一飛，尹書斌，趙玉萍

(川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院神經內科，四川 南充 637000)

異秦皮素(isofraxidin，ISO)是從刺五加提取的一種香豆素類化合物[1]。隨著醫療技術的發展，ISO的臨床應用越來越多，如在人類癌癥[2-4]、炎癥疾病[5-6]和氧化應激[7-8]中的抑制作用。Chen等[8]發現，ISO在體內和體外均可抑制NLRP3炎癥小體的激活，從而改善心肌梗死預后。然而，ISO在腦梗死中的具體功能及其與NLRP3炎性小體之間的相互作用尚不清楚。因此，本研究擬探討ISO在腦梗死中的調控機制及其與NLRP3炎性小體的相關性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

32只雄性SD大鼠(220～240 g)購自川北醫學院實驗動物中心，適應實驗環境7 d。本研究的動物實驗程序嚴格按照《實驗動物護理使用指南》進行，并經醫院倫理委員會批準，倫理批號：NSMC倫理動物審[2021]69號。

1.2 主要試劑及儀器

ISO(武漢遠成共創科技有限公司)；活性氧(ROS)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒、IL-10試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-18試劑盒、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)抗體試劑盒、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)抗體試劑盒、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體試劑盒(Abcam公司)；SDS-PAGE凝膠制、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(北京索萊寶科技有限公司)。鼠大腦中動脈閉塞模型(MCAO)；栓線(型號：2636-A4TC)；全波長酶標儀(美國，Multiskan)；電子分析天平(LCD-A500)、高速冷凍離心機(德國，Sigma 1-15K)；恒溫水浴箱(ZWY-110X50)。

1.3 實驗方法

1.3.1 腦梗死大鼠模型及ISO處理 SD大鼠適應實驗環境7 d后，分為假手術組(sham組)、MCAO組、ISO 10組(10 mg/kg)和ISO 20組(20 mg/kg)，每組均為8只。ISO組腹腔注射相應劑量的ISO，1次/d；sham組、MCAO組腹腔注射相同體積生理鹽水。持續8周。取相應標本做后續的研究。MCAO操作按照Longa等[9]的研究進行：將SD大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，固定于手術臺，右側頸部備皮，作一長約2 cm的縱向切口，鈍性分離右側胸鎖乳突肌等肌肉，暴露分離右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈。結扎右側頸總動脈向心端和頸外動脈根部，動脈夾夾閉頸總動脈遠心端，在右側頸總動脈下方穿一線備用。在分叉處下方約8 mm處作一切口，將線栓插入右側頸總動脈，收緊備用線，松開動脈夾，當線栓送入約20 mm深時，遇到輕微阻力則輕微回拉1～2 mm，線栓穿過右側大腦中動脈起始端，將右側大腦中動脈起始端阻塞，結扎備線，固定線栓，然后迅速記錄時間，縫合皮膚，線栓尾端固定在皮膚上。缺血2 h后，小心將線栓抽出，恢復右側大腦中動脈血供，即形成MCAO模型。sham組大鼠僅給予同樣暴露分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈操作，但不做結扎和線栓處理。

1.3.2 神經行為評估 再灌注24 h及8周后，由兩位對本研究不知情的實驗者評估大鼠的神經行為，參照Zea-Longa[9]神經功能障礙評分：5分：不能行走，意識昏迷；4分：原地向左側旋轉；3分：左側旋轉步行；2分：左前肢阻力降低，行走偏左側；1分：提起鼠尾，左前肢不能完全伸直；0分：無明顯神經損傷。將模型組評分為1～4分且無蛛網膜下腔出血的大鼠納入后續實驗，剔除評分為5分的大鼠，并隨機補充。

1.3.3 染色分析 用50 mg/kg戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉。麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于木板上，剪開腹腔，暴露心臟，經左心室灌流，肉眼觀察到生理鹽水基本無色和肝臟完全變黃后停止沖洗，再以4%多聚甲醛灌注固定，大鼠全身僵硬后斷頭取出腦組織，用手術刀沿正中裂矢狀位把大腦切幵，將右側大腦半球置于4%多聚甲醛固定液4 ℃下固定24 h，在視交叉后1 mm及5 mm處冠狀切面切開，取中間腦組織。置于4%多聚甲醛固定液4 ℃固定24 h，石蠟包埋后，把大腦切片(4 μm厚)用于蘇木精-伊紅染色法(HE)染色、原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)染色試驗和Nissl染色。

1.3.4 大腦含水量的測量 大鼠麻醉后斷頭取腦，去除小腦、腦干及嗅球，用手術刀沿正中裂矢狀位把大腦切開，將右側大腦半球用精確度為0.01 mg電子分析天平測量濕重(wet weight，ww)，然后包入錫箔紙放置烤箱中，72 h后稱大腦干重(dry weight，dw)，按以下公式計算出大腦含水量[10]，含水量=(ww-dw)÷ww×100%。

1.3.5 氧化應激標志物檢測 取新鮮右側大腦半球，稱重后研磨并加入9倍質量的生理鹽水制成勻漿液，離心半徑6 cm，2 000 rpm離心10 min取上清，采用特異性酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，對ROS、MDA和SOD的含量進行測定。

1.3.6 ELISA試驗 大鼠麻醉后，腹腔注射麻醉，打開腹腔，腹主動脈采血4 mL，注入離心管中待凝固后，4 ℃，離心半徑6 cm，3 000 rpm離心10 min，分離血清，-20 ℃保存備用。大鼠采血后，迅速斷頭冰浴中取腦，取右側大腦半球，去掉嗅球、小腦和低位腦干等，吸去血跡，用電子天平稱重，盡快加入預冷的生理鹽水碾磨，制成組織勻漿，4 ℃，離心半徑6 cm，3 000 rpm離心15 min，取上清液-20 ℃備用。采用特異性ELISA試劑盒，檢測大鼠血清和腦組織中炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-18)水平。

1.3.7 Western blotting 取新鮮右側大腦半球，制備勻漿并提取總蛋白，然后用快速金BCA蛋白測定試劑盒測定濃度，用10% SDS-PAGE分離蛋白產物并轉移到PVDF膜上。將PVDF膜分別加入NLRP3、ASC和GAPDH的一抗，在4 ℃下孵育過夜，然后分別將二抗在室溫下孵育1 h。GAPDH為內參?；瘜W發光法顯色，應用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的分子量和凈光密度值。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 ISO改善腦梗死大鼠神經功能缺損和腦水腫

腦梗死大鼠各組神經功能評分較sham組升高，差異有統計學意義(P<0.01)。ISO可降低各組腦梗死引起的神經功能評分升高。MCAO組相對sham組評分升高(t=17.15，P<0.01)；ISO 10組的神經功能評分相對MCAO組降低(t=4.50，P<0.05)；ISO 20組的神經功能評分相對MCAO組降低(t=5.38，P<0.01)。腦梗死后各組腦組織水含量差異有統計學意義(P<0.01)，MCAO組相對sham組腦組織水含量升高(t=5.96，P<0.01)；ISO 10組相對MCAO組水含量降低，差異無統計學意義(P>0.05)；ISO 20組相對MCAO組水含量降低，且差異具有統計學意義(t=3.77，P<0.05)。見圖1。

2.2 ISO減輕腦梗死大鼠的神經元損傷

與sham組相比，腦梗死各組大鼠腦組織中TUNEL陽性細胞百分比增加，差異有統計學意義(P<0.01)。其中，MCAO組相對sham組TUNEL陽性細胞率升高(P<0.01)；ISO 10組TUNEL陽性細胞率相對MCAO組降低(P<0.01)；ISO 20組TUNEL陽性細胞率相對MCAO組降低(P<0.01)。ISO處理可減輕腦梗死后TUNEL陽性細胞的增加，差異有統計學意義(P<0.01)。HE染色顯示四組的組織學變化中，sham組無明顯組織病理異常，細胞輪廓清晰，核仁明顯。然而，腦梗死后出現細胞輪廓模糊、細胞變形和水腫等異常。ISO可減輕上述損傷，且ISO 20組對細胞病理狀態的改善更為明顯。Nissl染色則顯示，sham組的神經元完好，而腦梗死誘導的神經元損傷伴隨細胞體和核仁萎縮。與HE染色結果相似，ISO處理可明顯減輕腦梗死后神經元的損傷。見圖2。

2.3 ISO減輕腦梗死引起的大鼠氧化應激

與sham組相比，腦梗死各組ROS含量升高(P<0.01)、MDA含量升高(P<0.01)，SOD含量降低(t=22.80，P<0.01)。ISO處理后可減輕氧化應激，ISO 10組和ISO 20組相對MCAO組，ROS含量、MDA含量均降低(P<0.01)，SOD含量升高(P<0.01)。見圖3。

2.4 ISO減輕腦梗死引起的炎癥反應

據報道[11-12]，腦梗死后炎癥的加重促進了神經元和腦組織損傷。因此，本研究分析ISO處理對腦梗死后大鼠炎癥反應的影響。血清和腦組織結果顯示，腦梗死后TNF-α和IL-6水平較sham組升高，差異有統計學意義(均P<0.01)。與MCAO組相比，ISO 10組TNF-α、IL-6水平降低，差異有統計學意義(P<0.01)，ISO 20組對炎癥因子釋放的抑制作用更明顯。MCAO組與sham組大鼠血清及腦組織的抗炎因子IL-10水平差異均無統計學意義(P>0.05)。與MCAO組相比，ISO組IL-10水平呈劑量依賴性增加，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

2.5 ISO抑制腦梗死大鼠NLRP3炎性小體活化

由于NLRP3炎性小體的激活伴隨著IL-1β和IL-18的釋放在腦梗死后炎癥反應的調控中起著重要的作用[13-15]，于是研究了腦梗死大鼠腦組織中NLRP3炎性小體相關蛋白的水平及IL-1β和IL-18的含量。Western blotting的結果表明，NLRP3和ASC的蛋白水平在腦梗死大鼠中上調，差異有統計學意義(P<0.01)，ISO 10組、ISO 20組表達水平下降，差異均有統計學意義(P<0.01)。同時，在腦梗死大鼠腦組織中IL-1β和IL-18的含量在腦梗死大鼠中上調，差異有統計學意義(P<0.01)，ISO 10組、ISO 20組表達水平下降，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

3 討論

腦梗死是一種全球發病率較高的嚴重腦血管疾病，目前尚無有效的臨床藥物，其臨床管理仍頗具挑戰性。缺氧和神經炎癥引起的腦損傷貫穿于腦梗死急性期整個過程。因此，抑制神經炎癥和氧化應激成為腦梗死治療的主要應對策略。

ISO在炎癥應激下產生抗菌、抗炎和抗腫瘤作用，因其在腦梗死中的臨床應用逐漸普及。既往研究[16-17]表明，ISO通過調節細胞外調節蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、p38的磷酸化活性顯著抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的整體炎癥反應水平，并緩解急性肺損傷中的炎癥反應以減輕肺部損傷。

腦梗死后多出現神經元凋亡、核仁萎縮、水腫。本研究中，ISO顯著降低腦梗死引起的神經功能評分和腦組織含水量，并減輕上述損傷，提示ISO對腦梗死大鼠具有保護作用，可能是一種治療腦梗死的有效藥物。

腦組織易受氧化應激的影響可歸因于神經遞質自動氧化、線粒體功能紊亂和不飽和脂質的富集等[18-20]。Zhao等[20]認為，在大鼠腦梗死再灌注損傷模型中，MDA水平增加，而SOD含量下降，ROS、MDA和SOD之間的平衡可用于評估氧化應激對腦損傷的影響。本研究中，ISO可降低ROS和MDA的水平，并上調SOD表達，ISO 20組尤為明顯，表明ISO對腦梗死的保護作用之一可能是抗氧化作用。

促炎癥細胞因子如TNF-α和IL-6，以及抗炎因子IL-10也被證實參與了腦梗死后炎癥調節過程[21-22]。本研究顯示，在血清和受傷的腦組織中，ISO明顯抑制了TNF-α和IL-6的分泌，ISO劑量在20 mg/kg時對炎癥因子釋放的抑制作用更明顯；同時呈劑量依賴性促進了IL-10的釋放，表明ISO可減輕腦梗死炎癥反應。

NLRP3炎性小體是一種亞細胞多蛋白復合物，與神經炎癥密切相關，包括NLRP3和ASC等重要蛋白，可促進IL-18和IL-1β的產生[22]。Yang等[23]在NLRP3(-/-)小鼠中進行了大腦中動脈閉塞再灌注實驗，發現下調NLRP3可通過抑制IL-1β的分泌，顯著減少梗死區域，減輕血腦屏障的損傷。Xiao等[24]發現，腦出血是卒中最致命的亞型，可誘導NLRP3炎性小體的激活，導致一系列炎癥反應和神經炎癥，加重腦損傷。Joaquim等[25]在腦缺血/再灌注損傷模型中注射NLRP3抑制劑MCC950，發現MCC950可降低腦組織的過氧化作用。本研究中，ISO不僅抑制了NLRP3和ASC的蛋白水平，而且還減少了MCAO大鼠的IL-18和IL-1β的產生，提示NLRP3炎性小體是ISO治療腦梗死的靶點，與既往研究[22-25]結果基本一致。

綜上，ISO可降低腦梗死引發的神經功能評分和腦組織含水量，減輕神經元凋亡、核仁萎縮、水腫程度，降低ROS、MDA、TNF-α、IL-6、IL-18、IL-1β、NLRP3和ASC的表達水平，上調SOD、IL-10表達，減輕神經炎癥反應，可能是腦梗死的潛在治療藥物。