高效液相色譜法測定檸檬酸三甲酯含量及有關物質*

張 冬，王 強，畢 華，靳 玲，高燕霞

（河北省藥品醫療器械檢驗研究院，河北 石家莊050200）

檸檬酸三甲酯又稱枸櫞酸三甲酯，多由檸檬酸經酸催化進行酯化反應制得［1-4］，具有生物降解性好、無毒、不易揮發、抗細菌等優點［5］，是一種環境友好型醫藥中間體，且性能較穩定，廣泛應用于醫藥、食品、化工等領域。其作為樣本中的微量成分之一，通常采用氣相色譜（GC）法或氣相色譜-質譜（GC-MS）法檢測［6-10］，但對于主成分的定量分析，GC法及GC-MS法存在重復性差、儀器普及率較低等缺點。本研究中建立了測定檸檬酸三甲酯含量及有關物質的高效液相色譜法，采集并分析自制樣品的表征數據，以提高其定量分析的準確性，并為其合成工藝的改進提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外可見分光光度儀（日本島津公司）；Mettler XS 205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

檸檬酸三甲酯對照品（上海譜振生物科技股份有限公司，克拉瑪爾試劑，批號為ZY160517，含量為98%）；檸檬酸三甲酯（自制樣品，批號分別為D0414，D0421，D0512）；甲醇、四氫呋喃、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、檸檬酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH至2.5）-乙腈（90∶10，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，采用強酸破壞（0.1 mol/L鹽酸溶液）供試品溶液10 min，結果理論板數為9 958，拖尾因子為1.2，檸檬酸三甲酯與相鄰雜質峰的分離度為12.9，符合2020年版《中國藥典（四部）》［11］中方法學驗證的相關規定。

2.2 含量測定

2.2.1 溶液制備

分別取檸檬酸三甲酯對照品和樣品各適量，精密稱定，分別加流動相溶解并稀釋成質量濃度為1 mg/mL的溶液，搖勻，濾過，作為對照品溶液及供試品溶液。

取檸檬酸三甲酯對照品25 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液1 mL，搖勻，放置10 min，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，用流動相稀釋并定容，搖勻，濾過，作為系統適用性試驗溶液。

2.2.2 方法學考察

線性關系考察：取檸檬酸三甲酯對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋成質量濃度分別為1.3，6.6，13.3，26.6，53.2 μg/mL的系列對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1 061X+203.93（r=0.999 8，n=5）。結果表明，檸檬酸三甲酯質量濃度在1.3～53.2 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限和檢測限確定：精密量取2.2.1項下對照品溶液適量，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1時的質量濃度計算檸檬酸三甲酯的定量限和檢測限，結果分別為26 ng和13 ng。

精密度試驗：取2.2.1項下對照品溶液20 μL，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次。結果檸檬酸三甲酯峰面積的RSD為0.04%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為D0512）適量，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于室溫下放置0，1，2，3，4，5，6，8 h時進樣測定。結果的RSD為0.60%（n=8），表明供試品溶液于室溫下放置8 h內穩定。

加樣回收試驗：取樣品（批號為D0512）9份，每份50 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，另分別取檸檬酸三甲酯對照品30，50，70 mg，各3份，分別置上述容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，濾過，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果檸檬酸三甲酯的平均加樣回收率為99.98%，RSD為0.54%（n=9），表明方法準確度好。

耐用性試驗：改變色譜柱［Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Capcell Pak MGⅡC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、DiamonsilTMC18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）］，流速（0.9，1.0，1.1 mL/min），柱溫（30，35，37℃），乙腈體積分數（9.5%，10.0%，10.5%），流動相pH（2.3，2.5，2.7），微量調整色譜條件。取樣品（批號為D0512），依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果改變色譜條件，檸檬酸三甲酯含量的RSD不超過0.21%，表明方法耐用性好。

2.2.3 樣品含量測定

取3批（批號分別為D0414，D0421，D0512）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果3批自制檸檬酸三甲酯樣品的含量分別為98.54%，98.89%，98.71%。

2.3 有關物質分析

2.3.1 溶液制備

取樣品50 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流動相稀釋并定容，搖勻，濾過，作為對照溶液。

2.3.2 方法學考察

專屬性試驗：采用強酸（0.1 mol/L鹽酸溶液10 min）、強堿（0.1 mol/L氫氧化鈉溶液10 min）、高溫（加熱熔融）、氧化（10%過氧化氫溶液10 min）、強光照射（照度為4 500 lx，24 h）對供試品溶液進行加速破壞，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的5倍。結果不同破壞途徑，供試品溶液中所含雜質量均不同程度增加，酸、堿破壞供試品溶液中雜質檢出量較大，提示供試品溶液在酸、堿條件下不穩定；氧化破壞對供試品溶液影響較小。色譜圖見圖1。雜質b及高溫破壞試驗中保留時間1.3倍處雜質的檢出量較小，故未進行定性分析，有待進一步研究。主要產生有關物質檸檬酸、雜質a、雜質c。其中，檸檬酸雜質峰通過保留時間與檸檬酸試劑主峰保留時間的一致性進行定性；采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法初步分析雜質a與雜質c的化學結構，雜質a與檸檬酸單甲酯的化學結構一致，雜質c與檸檬酸雙甲酯的化學結構一致。鑒于破壞試驗中所產生的雜質峰均位于主成分峰保留時間前，僅高溫破壞在主峰保留時間1.3倍處檢出一雜質峰，故設定樣品測定洗脫時間為主成分峰保留時間的2倍。

穩定性試驗：取供試品溶液（批號為D0512）適量，分別于室溫放置0，1，2，3，4，5，6，8 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。供試品溶液雜質含量隨時間變化的情況見表1。可見，8 h內檸檬酸、雜質b的含量均無明顯變化；3 h時雜質a含量增加較多，說明溶劑的酸性環境對樣品有一定影響，可導致雜質a含量增加，這與酸破壞試驗結果一致。故供試品溶液應在室溫放置2 h內完成檢測。

表1 穩定性試驗結果（%）Tab.1 Results of the stability test（%）

2.3.3 樣品有關物質測定

取3批（批號分別為D0414，D0421，D0512）樣品各適量，按2.3.1項下方法制備供試品溶液；取檸檬酸三甲酯對照品（批號為ZY160517）適量，制備對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，結果3批供試品溶液中雜質總和均低于1.00%，且雜質個數及雜質含量基本一致，均優于市售克拉瑪爾試劑。表明自制樣品合成工藝穩定，質量滿意。詳見表2。

表2 有關物質測定結果（%）Tab.2 Results of determination of related substances（%）

2.3.4 質量守恒驗證試驗

分別用3批（批號分別為D0414，D0421，D0512）樣品制備的供試品溶液的主峰峰面積與總雜質峰面積之和除以相同濃度酸破壞后的供試品溶液主峰峰面積與總雜質峰面積之和，結果分別為100.57%，99.92%，101.15%，介于98%～102%范圍內，提示該方法可有效檢出降解產生的雜質。

2.4 自制樣品表征數據分析

紅外吸收光譜：3批（批號分別為D0414，D0421，D0512）樣品均在1 750～1 650 cm-1波數范圍內檢出三重峰，在3 500～3 250 cm-1波數范圍內檢出羥基峰，這符合檸檬酸三甲酯存在3個羰基、1個羥基的結構特征，與檸檬酸三甲酯對照品紫外光譜圖一致。

熔點檢測：自制樣品的熔程為76.0～77.2℃，檸檬酸三甲酯熔程為75～78℃，可見自制樣品的熔程較短，純度較高。

表觀及晶型檢查：自制樣品晶體潔白，透明度高，純度較好，80倍顯微鏡下呈塊狀結晶。

3 討論

3.1 初始流動相選擇

反相鍵合相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入與水互溶的甲醇、乙腈、四氫呋喃等極性調整劑。研究報道，以25 mmol/L（NH4）2HPO4（用磷酸調pH至2.5）-甲醇-四氫呋喃（80∶20∶3，V/V/V）為流動相，采用2.1項下色譜條件進行重復試驗，結果流動相中由于含有四氫呋喃，本底吸收較大，且四氫呋喃增加了流動相的極性，檸檬酸和檸檬酸三甲酯洗脫較快，使檸檬酸峰與溶劑峰部分疊合，無法對檸檬酸進行準確定量，另四氫呋喃對流路中peak管有一定腐蝕，故流動相中不再選擇四氫呋喃。與甲醇相比，乙腈洗脫能力較強，且黏度較小，可滿足在185～214 nm波長范圍內檢測的要求，故流動相選擇乙腈。

3.2 色譜條件優化

檸檬酸是制備檸檬酸三甲酯的主要原料，檸檬酸三甲酯有關物質中是否含有檸檬酸可作為反應是否完全的依據。檸檬酸易在水中發生電離，導致出現多峰現象，影響測定。為使檸檬酸以分子形式存在，選用酸性流動相以抑制檸檬酸解離，同時加入一定比例緩沖鹽保持流動相pH值穩定。

檸檬酸三甲酯和檸檬酸的分子結構中無共軛雙鍵，其在紫外區無明顯紫外吸收，但二者均在190～230 nm波長范圍內有吸收帶，故檢測波長可選擇末端吸收，為減少檢測波長過低所引起的基線干擾，最終確定檢測波長為214 nm。

許多緩沖液在210 nm波長附近有較強紫外吸收，使基線增高，檢測靈敏度降低，對常用的4種無機鹽溶液（25 mmol/L磷酸二氫鉀溶液、25 mmol/L磷酸二氫銨溶液、25 mmol/L磷酸氫二銨溶液、25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液）進行紫外掃描，結果磷酸二氫鈉溶液的紫外吸收光譜圖較平緩，更接近基線，故緩沖液選用磷酸二氫鈉溶液。

3.3 方法評價

由于無法買到正規對照品，以市售精制試劑作為檸檬酸三甲酯對照品，其含量標注不低于98%，以98%計算，3批自制樣品含量實測值均大于對照品的含量，表明合成工藝良好。該方法快速、簡便、精確、可靠，可為檸檬酸三甲酯的質量控制提供有效的分析方法。