香茶菜質量標準研究*

汪正宇，郭秀秀，方 敏，趙向陽，魯 輪，韓正賓，郭明飛

（1.安徽省宿州市食品藥品檢驗檢測中心，安徽 宿州234000；2.安徽省質量和標準化研究院，安徽 合肥230051；3.安徽省宿州綠源中醫藥科技有限公司，安徽 宿州234000；4.安徽省宿州市市場監督管理局，安徽 宿州234000）

香茶菜Rabdosia amethystoides（Benth.）Hara為唇形科植物香茶菜的全草，是民間習用草藥，始載于《救荒本草》［1］，別名有鐵稜角、蛇總管、山薄荷、蛇通管、小葉蛇總管、母豬花頭、盤龍七、王棗子等［2-4］?！毒然谋静荨访枋鲂螒B為：“香茶菜，生田野中。莖方窊（五化切）面四楞，葉似薄荷葉，微大，抪葉對生。梢頭出穗，開粉紫花，結蒴如蕎麥蒴，微小。葉味苦?！薄吨腥A本草》［5］指出，“今唇形科香茶菜與《救荒本草》中香茶菜形態描述相符”，故《救荒本草》中記載的香茶菜與現代本草香茶菜為同一植物?！吨袊参镏尽罚?］記載，香茶菜生于海拔為200～920 m的林下或草叢中濕潤處，產自廣東、廣西、貴州、福建、臺灣、江西、浙江、江蘇、安徽及湖北。香茶菜主要活性成分有二萜類［6-9］、三萜類［10-11］、揮發油類［12-13］等成分，具有較強的抗菌消炎［7，14-15］、抗腫瘤［7，15-16］、保護肝損傷［17-19］等藥理活性，其中萜類成分為抗腫瘤的主要活性成分。目前，以香茶菜入藥的制劑有胃復春片、人參香茶片、抗癌平等［20-21］?！吨袊幍洹肺词蛰d香茶菜藥材，2016年版《江蘇省中藥材標準》［22］、2017年版《浙江省中藥材標準》［23］及2019年版《安徽省中藥飲片炮制規范》［24］中均有收載，參照上述標準可擬訂“性味與歸經”“功能與主治”“用法與用量”“注意”“處方應付”“貯藏”項，但均無香茶菜中活性成分的定量檢測要求。本研究中從定性鑒別、檢查項及含量測定等方面建立了香茶菜的質量標準，旨在為其質量控制和進一步開發利用提供依據?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），配有2489型紫外-可見光檢測器和Empower色譜工作站；DM750型生物顯微鏡（德國徠卡公司，Toup-CamE3CMOS成像系統）；Camag TLC Scanner3型薄層掃描儀（瑞士卡瑪公司）；FP240型精密干燥箱（德國賓德公司）；KSL-1200X-M型高溫箱式爐（27 L，合肥科晶材料技術有限公司）；TA-27型超聲波清洗器（湖北鼎泰高科有限公司，功率為700 W，頻率為40 kHz）；AB-135S型電子天平（精度為0.01 mg），BSA 124S型電子天平（精度為0.1 mg），均購于德國賽多利斯公司。

1.2 試藥

齊墩果酸對照品（批號為110709-201808，含量91.1%），熊果酸對照品（批號為110742-201220，含量99.3%），均購于中國食品藥品檢定研究院；香茶菜對照藥材（成都植標化純生物有限公司，批號為200416）；甲醇、乙腈（色譜純，美國天地有限公司）；水為純化水，其他試劑均為分析純。香茶菜共13批，其中宿州市王棗子藥材種植基地、王二嫂子藥材種植基地采集10批，安徽省中藥材標準起草領導小組提供3批，經安徽省中醫藥大學劉金山教授鑒定為正品。樣品信息見表1。

表1 香茶菜藥材樣品信息Tab.1 Information of Rabdosia amethystoides samples

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別［2］

香茶菜樣品和《中華本草》描述一致，為多年生本草，高0.3～1.5 m；根莖肥大，疙瘩狀，木質；莖直立，四棱形，被倒向柔毛；葉對生；葉柄長0.2～2.5 cm；葉片卵狀披針形，長0.8～11.0 cm，寬0.7～3.5 cm，先端漸尖，基部楔形下延于葉柄，邊緣基部以上具圓齒，兩面被短柔毛，有時近五毛，均具腺點。二歧聚傘花序多花，組成頂生疏散的圓錐花序；苞片針狀、小，但較顯著；花萼鐘形，長約2.5 mm，外面被極短硬毛或近無毛，并具腺點，萼齒5，三角形，近相等，花萼白色、藍白色或紫色，長約7 mm，外面被短柔毛，內面無毛，上唇外反，先端4圓裂，下唇闊圓形，內凹呈舟形；雄蕊4，二強，內藏；子房4裂，花柱與雄蕊等長，柱頭2淺裂；花盤杯狀。小堅果卵形，褐色?；ㄆ?～10月，果期7～11月。

2.2 顯微鑒別（藥材粉末）

本品藥材粉末灰棕色。葉上、下表皮細胞呈類多角形或不規則形，表面有眾多非腺毛和腺鱗，氣孔不定式（圖1 A）；非腺毛多碎斷，完整者4～6個細胞，表面有疣狀突起，頂端尖或稍彎，部分細胞常縊縮（圖1 B）；腺鱗頭部扁球形，2～4個細胞，直徑20～38 μm（圖1 C）；韌皮纖維細長梭形（圖1 D）；木纖維成束或散在，細胞壁不規則增厚（圖1 E）；石細胞可見類方形、長方形或不規則形，胞腔較大，有細密紋孔（圖1 F）。

A.葉上、下表皮細胞及氣孔B.非腺毛C.腺鱗D.韌皮纖維E.木纖維F.石細胞圖1香茶菜粉末顯微鑒別（×200）A.Upper and lower epidermal cells and stomatas of leaves B.Non-glandular hairs C.Glandular scales D.Bast fibers E.Wood fibers F.Stone cellsFig.1 Microscopic identification of Rabdosia amethystoides powder（×200）

2.3 薄層色譜鑒別

取樣品粉末0.5 g，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，濾過，作為供試品溶液。另取香茶菜對照藥材0.5 g，同法制得對照藥材溶液。取熊果酸對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。取熊果酸對照品溶液、對照藥材溶液及13批樣品的供試品溶液，照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（4.5∶0.5∶1∶0.1，V/V/V/V）為展開系統，于相對濕度低于70%環境下展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，詳見圖2。

S.熊果酸對照品溶液S′.對照藥材溶液1-13.供試品溶液圖2香茶菜薄層色譜圖S.Ursolic acid reference solution S′.Reference medicinal material solution 1-13.Test solutionFig.2 TLC chromatograms of Rabdosia amethystoides

2.4 水分、總灰分及酸不溶性灰分檢查

采用2020年版《中國藥典（四部）》通則0832水分測定法第二法（烘干法）測定含水量，通則2302總灰分測定法測定總灰分和酸不溶性灰分含量。結果13批樣品水分為6.62%～9.45%，平均7.72%；總灰分為3.22%～5.64%，平均4.61%；酸不溶性灰分為0.08%～0.26%，平均0.18%。擬訂水分限度為“不得過10.0%”，總灰分限度為“不得過6.0%”。因酸不溶性灰分較少，課題組認為香茶菜引入外源性無機鹽雜質較少，香茶菜中酸不溶性灰分風險可控，故酸不溶性灰分的檢查不納入本標準。詳見表2。

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分測定結果（%）Tab.2 Results of content determination of moisture，total ash and acid-insoluble ash（%）

2.5 浸出物測定

采用2020年版《中國藥典（四部）》通則2201項下浸出物測定法測定水溶性和醇溶性浸出物含量。結合前期考察T1-T6批樣品的熱浸法結果，稀乙醇和水浸出物含量較高，故冷浸法提取時著重考察了上述2種溶劑，結果熱浸法優于冷浸法。因香茶菜植物主要藥效成分為二萜類、三萜類化合物，結合指標成分含量測定結果，確定含量最高的浸出物試驗溶劑為乙醇和70%乙醇。由表3可知，70%乙醇浸出物含量較乙醇熱浸法高，故確定以70%乙醇為提取溶劑，采用醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定香茶菜浸出物。由表3可知，13批樣品采用70%乙醇熱浸法提取浸出物均值為15.79%。考慮個別樣品的測定數據，將限度適當下浮，擬訂浸出物限度為“不得少于8.5%”。

表3 浸出物測定結果（%）Tab.3 Results of content determination of extract（%）

2.6 齊墩果酸和熊果酸含量測定

2.6.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-含12 mmol/L羥丙基-β-環糊精的0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，供試品溶液色譜圖中，雜質峰對主峰無干擾，齊墩果酸與熊果酸的分離度大于1.5，峰對稱因子在0.90～1.20之間，理論板數以齊墩果酸及熊果酸峰計大于8 000，對照品溶液重復進樣5次的RSD不超過1.5%，且空白試劑無干擾。色譜圖見圖3。

2.6.2 溶液制備

取齊墩果酸對照品、熊果酸對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含齊墩果酸0.202 2 mg、熊果酸0.314 4 mg的混合對照品貯備液；精密量取貯備液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，混勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得混合對照品溶液。取香茶菜藥材粉末（過2號篩）及對照藥材各1.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）60 min，放冷，再稱定質量，加乙醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.6.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取2.6.2項下混合對照品貯備溶液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，得系列質量濃度的混合對照品溶液，按2.6.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖峰面積，以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得齊墩果酸和熊果酸的線性回歸方程分別為Y齊=10 431X齊+18 547（r=0.997 3，n=8）、Y熊=8 894X熊+24 743（r=0.997 4，n=8）。結果表明，齊墩果酸和熊果酸質量濃度分別在4.04～202.20 μg/mL和6.29～314.40 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

1.齊墩果酸2.熊果酸A.空白試劑B.對照品溶液C.供試品溶液圖3高效液相色譜圖1.Oleanolic acid 2.Ursolic acidA.Blank solvent B.Reference solution C.Test solutionFig.3 HPLC chromatograms

定量限確定：取混合對照品溶液，按10倍稀釋，得系列定量限檢測溶液，按2.6.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖峰面積，以信噪比（S/N）為10∶1時的質量濃度為定量限。結果齊墩果酸和熊果酸的定量限分別為2.12 μg/mL和3.14 μg/mL。

精密度試驗：取2.6.2項下混合對照品溶液，按2.6.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖峰面積。結果齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別0.40%和0.62%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（編號為T1）香茶菜藥材粗粉，按2.6.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，18，24 h時測定，記錄色譜圖峰面積。結果齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.83%和1.15%（n=7），表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（編號為T1）香茶菜藥材粗粉，按2.6.2項下方法平行制備供試品溶液6份，按2.6.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖峰面積。計算含量。結果齊墩果酸含量分別為0.455，0.470，0.467，0.464，0.470，0.464 mg/g，熊果酸含量分別為0.718，0.722，0.728，0.722，0.727，0.724 mg/g，RSD分別為1.17%和0.40%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的香茶菜（編號為T6）粗粉0.625 g，精密稱定，平行6份，置100 mL具塞錐形瓶中，分別加入每1 mL含齊墩果酸0.210 4 mg、熊果酸0.333 0 mg的溶液1.5 mL，按2.6.2項下方法制備供試品溶液，按2.6.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖峰面積，并計算加樣回收率及RSD。結果見表4。

表4 香茶菜加樣回收試驗結果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test of Rabdosia amethystoides（n=6）

2.6.4 樣品含量測定

取2.6.2項下混合對照品溶液、對照藥材溶液及13批藥材樣品供試品溶液，按2.6.1項下色譜條件進樣測定3次，記錄色譜圖峰面積，分別按外標法計算含量。由表5可知，對照藥材中齊墩果酸及熊果酸含量和樣品中含量相當，13批香茶菜樣品中齊墩果酸含量為0.018%～0.082%、平均0.037%，熊果酸含量為0.055%～0.167%、平均0.087%，二者含量總和為0.074～0.249%、平均0.124%，表明不同產地及不同采樣地點，二者含量存在一定差異。擬訂含量為“本品按干燥品計算，含齊墩果酸（C30H48O3）和熊果酸（C30H48O3）的總量不得少于0.06%?！?/p>

表5 香茶菜含量測定結果（n=3，%）Tab.5 Results of the content determination of oleanolic acid and ursolic acid in Rabdosia amethystoides（n=3，%）

3 討論

3.1 色譜條件優化

齊墩果酸及熊果酸是普遍存在于中草藥中的三萜類化合物，二者的化合物結構十分相似，屬同分異構體。本研究中先后參考《中國藥典》收載的木瓜、枇杷葉、翼首草等齊墩果酸及熊果酸含量測定項下的色譜條件，結果混合對照品溶液色譜峰分離不理想，且重復性不好。而在流動相中加入適宜濃度的羥丙基-β-環糊精，在分離手性化合物方面分離作用較好，通過反復試驗，摸索出流動相中加入12 mmol/L羥丙基-β-環糊精，結果2個目標化合物分離度均達到2.5以上，且在流動相中加入1%三乙胺能有效改善峰形。柱溫、檢測波長、進樣量等其他參數參考藥典相應品種方法都有較好的系統適用性。

3.2 測量結果分析

考察薄層色譜鑒別條件時，分別考察不同提取條件［提取溶劑（甲醇、乙醇、氯仿、乙醚）、提取方式（超聲、加熱回流）］、不同廠家薄層板、不同點樣量、不同點樣方式（點狀、條帶狀）及不同溫濕度等條件，結果以乙醇作為溶劑，超聲提取分離效果較好，該方法對其他條件的耐受性較好，能滿足試驗要求，測得色譜圖斑點顯色清晰。由表5可知，13批樣品中齊墩果酸和熊果酸含量存在一定差異，本研究中選取香茶菜地上部分開展試驗，引起含量差異的原因可能與采樣地點或季節有關，課題組將在后續工作中對此進行探討。

3.3 方法評價

本研究中建立了香茶菜中齊墩果酸及熊果酸的含量測定方法，并對13批藥材樣品進行薄層色譜鑒別，測定其水分、灰分、浸出物含量，并設定各項目限度值，初步完成了香茶菜的質量標準研究工作。該方法簡單、實用，可為香茶菜藥材質量的評價和監督提供參考。