氣相色譜-火焰光度法檢測羥苯磺酸鈣中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的殘留量*

汪鑫，章華

（1.湖北省武漢藥品醫療器械檢驗所，湖北 武漢430075；2.湖北廣辰藥業有限公司，湖北 宜昌443000）

硫酸二甲酯和硫酸二乙酯具有典型的遺傳毒性致癌物警示結構，可通過核酸烷基化而損害遺傳性基因和誘變染色體，是潛在的致癌物質和基因毒性雜質［1］。由于其高風險性，歐洲聯盟在2012年就將其列入第八批需授權高度關注物質（SVHC）候選清單，制藥企業與監管機構也越來越重視對該類雜質的檢測與控制。羥苯磺酸鈣是一種血管保護藥，能選擇性作用于毛細血管壁，顯著改善血管微循環，臨床廣泛應用于糖尿病視網膜病變等疾病的治療［2-7］。羥苯磺酸鈣的合成工藝［8-9］中會使用大量濃硫酸和甲醇、乙醇等醇類有機溶劑，高溫條件下可能生成硫酸二甲酯和硫酸二乙酯［10-11］。這2種物質的高毒性，使藥物的安全使用風險很大，故在羥苯磺酸鈣質量標準研究中，應對其殘留量進行嚴格監測和控制。本研究中參考硫酸酯類化合物現有文獻分析方法［12-15］，采用氣相色譜-火焰光度（GC-FPD）法對羥苯磺酸鈣中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的殘留量進行檢測，并進行方法學驗證。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Trace1300型氣相色譜儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司），配有SSL（分流/不分流進樣口）、火焰光度檢測器（FPD）、Chromeleon工作站）；Vortex-5型渦旋儀（其林貝爾儀器制造有限公司）；AG285型電子天平（梅特勒-托利多公司，精度為0.01 mg）；SK250HP型超聲清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；L530型醫用離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 試藥

硫酸二甲酯對照品（批號為FL060159，純度99.0%），硫酸二乙酯對照品（批號為F1505086，純度99.5%），均購自阿拉丁試劑上海有限公司；試驗用水為超純水；乙酸乙酯（色譜純，美國Fisher公司）；羥苯磺酸鈣原料藥（批號分別為202111021，202111022，202111023，均由A企業提供）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-WAX毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；程序升溫：起始溫度為70℃、保持2 min，以10℃/min的速率升至180℃；檢測器：FPD；檢測器溫度：150℃；燃氣：氫氣，流速90 mL/min；助燃氣：空氣，流速115 mL/min；載氣：氮氣，流速：5 mL/min；進樣口溫度：230℃；進樣量：2 μL；進樣方式：直接進樣，不分流。

2.2 溶液制備

取硫酸二甲酯對照品和硫酸二乙酯對照品各25 mg，精密稱定，置同一25 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯定容，搖勻，作為混合對照品貯備液；精密量取混合對照品貯備液適量，用乙酸乙酯定量稀釋成每1 mL含硫酸二甲酯和硫酸二乙酯各約0.1 μg的溶液，搖勻，作為混合對照品溶液。精密量取混合對照品溶液3.0 mL，置10 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋并定容，搖勻，作為靈敏度溶液。取羥苯磺酸鈣原料藥0.5 g，精密稱定，置10 mL帶蓋離心管中，精密加入乙酸乙酯5.0 mL，渦旋混合2 min，超聲10 min，以3 000 r/min的速率離心5 min，取上清液，經0.45 μm有機膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。將乙酸乙酯作為陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下混合對照品溶液、靈敏度溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。結果靈敏度溶液色譜圖中2個主峰的信噪比（S/N）均大于5；陰性對照溶液色譜圖中，在與硫酸二甲酯和硫酸二乙酯色譜峰相同保留時間處均無雜峰干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密量取2.2項下混合對照品貯備液適量，用乙酸乙酯逐級稀釋成每1 mL各約含硫酸二甲酯和硫酸二乙酯0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，2.00 μg的系列混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行二次曲線擬合，得硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的回歸方程，分別為Y甲=6.30X甲2+0.70X甲+0.035（r=0.998 6，n=6）、Y乙=6.72X乙2+0.44X乙+0.048（r=0.997 9，n=6）。結果表明，硫酸二甲酯和硫酸二乙酯質量濃度在0.04～2.00 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：取2.2項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按信噪比（S/N）分別為3∶1和10∶1時的含量計算檢測限和定量限。結果硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的檢測限分別為0.032 μg/g和0.028 μg/g，定量限分別為0.085 μg/g和0.077 μg/g。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果硫酸二甲酯和硫酸二乙酯峰面積的RSD分別為2.93%和3.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密稱取樣品（批號為20211021）0.5 g，加入混合對照品溶液適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果硫酸二甲酯和硫酸二乙酯峰面積的RSD分別為3.64%和3.48%（n=6），表明方法重復性良好。

1.硫酸二甲酯2.硫酸二乙酯A.陰性對照溶液B.靈敏度溶液C.供試品溶液D.混合對照品溶液圖1氣相色譜圖1.Dimethyl sulfate 2.Diethyl sulfateA.Negative reference solution B.Sensitivity solution C.Test solution D.Mixed reference solutionFig.1 GC chromatograms

穩定性試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件分別于0，4，8，12 h時進樣測定，記錄峰面積。結果硫酸二甲酯和硫酸二乙酯峰面積的RSD分別為3.12%和3.34%（n=4），表明混合對照品溶液12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的羥苯磺酸鈣原料藥（批號為20211021）0.5 g，共9份，分別加入低、中、高濃度的混合對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品殘留量測定

取3批樣品（批號分別為20211021，20211022，20211023）各適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，同時配制對照品溶液和靈敏度溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定。結果3批樣品均未檢出硫酸二甲酯和硫酸二乙酯。

3 討論

由于硫酸二甲酯和硫酸二乙酯在藥物中并未明確規定限度，本研究中參照國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）指導原則，以毒理學關注閾值（TTC）1.5 μg/d計算其可接受的限量［16］，以羥苯磺酸鈣臨床日最大使用量為1.5 g估算，將本品中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的限度擬訂為均不得過1 μg/g。考慮到測定對象是樣品中的微量雜質，為減少主藥對測定結果的干擾，選擇測定磷、硫元素的特異型檢測器FPD進行檢測；乙酸乙酯對硫酸二烷基酯易溶，對羥苯磺酸鈣幾乎不溶，選用乙酸乙酯作為提取溶劑，目標物經有效提取后，可直接進樣分析，與頂空衍生化法比較，處理過程簡單快捷；采用不分流模式進樣，提高了靈敏度，硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的檢測限可達0.03 μg/g，滿足限度需求。

綜上所述，所建立的方法操作簡便、靈敏度高、準確度好，可用于羥苯磺酸鈣原料藥中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯殘留量的日常監測，為該品種的質量控制提供科學依據。