蒙藥杠柳質量標準研究*

敖敦格日樂，拉喜那木吉拉△，吳香杰

（1.內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古 通遼028000；2.國家藥監局中藥＜蒙藥＞質量控制重點實驗室，內蒙古 通遼028000）

杠柳為蘿藦科植物杠柳Periploca sepiumBunge的帶葉嫩枝［1-3］，蒙藥名為亞曼-額布熱［4］或蘇圖-毛都［1-2］，性辛、溫，味甜，有毒［3，5-6］。個別地區將杠柳作為蒙藥材水柏枝的代用品，其功能主治與水柏枝相同，具有清熱、清協日烏素、透疹、斂毒作用［7］，主要分布于我國吉林、遼寧、內蒙古、河北、山西、山東、河南、四川、江蘇、甘肅、寧夏、陜西等省（直轄市、自治區）［1-3，8-9］。目前，該藥材的藥用部位為根，而傳統蒙藥藥用部位為帶葉嫩枝，但在帶葉嫩枝方面的研究甚少。本研究中對杠柳的根與嫩枝葉有效成分的差異及藥理作用進行研究，以建立杠柳的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JY02S型紫外分析儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；HH-W600型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；Shimadzu SPD-M20A LC-20AT型高效液相色譜儀（配有SPD-10AVP型檢測器、N3000色譜工作站），AUW220D型電子分析天平（精度為0.01/1.00 mg），均購自日本島津公司；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，超聲功率為100 W，加熱功率為400 W）；98-1-B型電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；BCD-246GNSE型冰柜（蘇州三星電子有限公司）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（批號為100081-201509，含量大于98.6%），山柰素對照品（批號為110861-201310，含量大于98%），4-甲氧基水楊醛對照品（批號為110790-201404，含量大于99%），均購自中國食品藥品檢定研究院；蒸餾水；硅膠GF254（青島海洋化工有限公司）；甲醇（分析純，批號為2014308），正己烷（分析純，批號為20150108），乙酸乙酯（分析純，批號為2014218），甲醇（色譜純，供薄層色譜鑒別用），均購自天津市大茂化學試劑廠。蒙藥杠柳（采集于2014年至2015年，采集部位為嫩枝葉）樣品來源信息見表1，其干燥帶葉嫩枝由遼寧省食品藥品檢定研究院王維寧教授及內蒙古民族大學吳香杰教授鑒定為正品，保存于國家民委-教育部蒙醫藥研發工程重點實驗室。

表1 樣品來源信息Tab.1 Source information of samples

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

稱取羧甲基纖維素鈉3 g，置1 000 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，振搖使完全溶解，即得0.3%羧甲基纖維素鈉水溶液。取硅膠GF254及0.3%羧甲基纖維素鈉水溶液，按1∶3（m/V）比例混勻，鋪勻在10 cm×20 cm的薄層板上，厚度為0.4～0.5 mm，105℃活化40 min，置干燥器內，即得硅膠GF254薄層板。

取樣品粉末1.0 g，加80%甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加10 mL水使溶解，乙醚振搖提取2次，每次10 mL，去掉乙醚液，水液加10 mL稀鹽酸，水浴加熱1 h，取出，迅速冷卻，乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用30 mL水洗滌，去掉水，蒸干乙酸乙酯液，殘渣加1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。取槲皮素對照品、山柰素對照品各適量，加甲醇制成每1 mL分別含槲皮素0.501 mg、山柰素0.504 mg的對照品溶液。

按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502試驗，吸取上述供試品溶液與對照品溶液各3 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，分別以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶1，V/V/V），三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（6∶4∶1，V/V/V），環己烷-乙酸乙酯-甲酸（6∶5∶1，V/V/V）為展開系統，展開，取出，晾干，熱風吹干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。色譜圖見圖1。從3個展開系統中選出斑點最清晰的進行耐用性試驗，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶1，V/V/V）為展開系統，考察上述溶液在不同溫濕度［室溫、低溫（5℃）、低濕度（室溫、相對濕度為20%）、高濕度（室溫、相對濕度為70%］的顯色情況。色譜圖見圖2。結果表明，方法耐用性良好。

1.槲皮素對照品溶液2.山柰素對照品溶液3-9.供試品溶液A.正己烷-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶1，V/V/V）B.三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（6∶4∶1，V/V/V）C.環己烷-乙酸乙酯-甲酸（6∶5∶1，V/V/V）圖1不同展開系統下蒙藥杠柳薄層色譜圖（254 nm）1.Quercetin reference solution 2.Kaempferol reference solution 3-9.Test solutionA.N-hexane-ethyl acetate-formic acid（9∶6∶1，V/V/V）B.Chloroform-ethyl acetate-formic acid（6∶4∶1，V/V/V）C.Cyclohexane-ethyl acetate-formic acid（6∶5∶1，V/V/V）Fig.1 TLC chromatograms of Mongolian medicine Periploca sepium with different development systems（254 nm）

1.槲皮素對照品溶液2.山柰素對照品溶液3-9.供試品溶液A.室溫B.低溫（5℃）C.低濕度（室溫、相對濕度為20%）D.高濕度（室溫、相對濕度為70%）圖2不同溫濕度條件下蒙藥杠柳薄層色譜圖［展開系統為正己烷-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶1，V/V/V）］1.Quercetin reference solution 2.Kaempferol reference solution 3-9.Test solutionA.Room temperature B.Low temperature（5℃）C.Low humidity（room temperature，relative humidity of 20%）D.High humidity（room temperature，relative humidity of 70%）Fig.2 TLC chromatograms of Mongolian medicine Periploca sepium under different temperature and humidity［the development system is n-hexane-ethyl acetate-formic acid（9∶6∶1，V/V/V）］

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Promosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（45∶55，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：32℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取4-甲氧基水楊醛對照品2.77 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，振搖使完全溶解，取1 mL，加甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，即得4-甲氧基水楊醛對照品溶液。取槲皮素對照品3.30 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，振搖使完全溶解，取1 mL，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，即得槲皮素對照品溶液。

取樣品粉末1 g，過40目篩，精密稱定，置150 mL圓底燒瓶中，精密加入50 mL甲醇-25%鹽酸（4∶1，V/V）溶液，密塞，稱定質量，水浴回流1 h，冷卻，再稱定質量，用甲醇-25%鹽酸（4∶1，V/V）溶液補足減失的質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：取2.2.2項下4-甲氧基水楊醛對照品溶液（質量濃度為0.110 8 mg/mL）和槲皮素對照品溶液（質量濃度為0.033 0 mg/mL），按2.2.1項下色譜條件分別進樣2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0 μL測定，以對照品溶液進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程分別為Y甲=62 606X甲-572.73和Y槲=3 130 900.433 0X槲-5 881.00（r=0.999 8，0.999 7，n=6）。結果表明，4-甲氧基水楊醛和槲皮素的進樣量分別在0.277 0～1.662 0 μg和0.082 5～0.495 0 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一批（批號為NK3）樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件依次進樣6次，記錄峰面積。結果4-甲氧基水楊醛和槲皮素峰面積的RSD分別為0.99%和1.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為NK3）樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8，12 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果4-甲氧基水楊醛和槲皮素峰面積的RSD分別為1.50%和1.15%（n=6），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為NK3）樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件下進樣測定，記錄峰面積。結果4-甲氧基水楊醛和槲皮素峰面積的RSD分別為1.47%和1.55%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為NK3）樣品0.5 g，精密稱定，共6份，均按1∶0.8，1∶1，1∶1.2比例精密加入4-甲氧基水楊醛、槲皮素對照品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=18）Tab.2 Results of the recovery test（n=18）

耐用性試驗：取同一批（批號為NK3）樣品0.5 g，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，改變色譜柱［Promosil C18柱、NertSustain?C18柱、Instrullc Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］和柱溫（32，35，40℃），其余色譜條件同2.2.1項下，進樣測定，記錄峰面積。結果4-甲氧基水楊醛和槲皮素峰面積的RSD均小于2.0%（n=3），表明方法耐用性良好。

2.2.4 樣品含量測定［11-12］

取7批樣品各適量，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果Tab.3 Results of content determination of 4-mthoxysalicylaldehyde and quercetin in samples

3 討論

蘿藦科植物杠柳是傳統蒙藥，藥用部位為干燥嫩枝［7］，《蒙藥學家羅布桑學術著作大成（3）蒙藥志》［3］中記載，其藥用部位為莖枝。杠柳莖枝中主要含有C21甾體類、萜類、強心苷類、醛類等化學成分，具有清熱、抗炎作用及燥協日烏素、斂毒、消腫等功效，其安全范圍小，個體差異大，易發生藥品不良反應［13］，莖葉中含有黃酮類成分，但對莖枝的研究報道甚少。前期研究發現，蒙藥水柏枝中主要含有黃酮類槲皮素和山柰素，通過薄層譜鑒別與含量測定發現，蒙藥杠柳嫩枝中也含有山柰素和槲皮素成分。但在中藥中其藥用部位為干燥根皮，主要含杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛［10］。

本研究中以槲皮素和山柰素為對照品，選用不同展開系統對不同產地的杠柳進行薄層色譜鑒別。由圖1可知，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（9∶6∶1，V/V/V）為展開系統時，薄層色譜斑點清晰，重復性好，易于鑒別。故選用該展開系統做耐用性試驗，室溫、低溫（5℃）、低濕度（室溫、相對濕度為20%）、高濕度（室溫、相對濕度為70%）條件下耐用性均良好，薄層色譜斑點清晰，分離度良好，比移值適中。

同時，采用高效液相色譜法檢測蒙藥對杠柳中主要成分4-甲氧基水楊醛和槲皮素的含量，方法學考察結果均符合規定。

綜上所述，該方法操作簡便、結果準確、專屬性強、重復性好［14-15］，可用于蒙藥杠柳的質量控制，有助于促進中（蒙）藥材的產業化，并帶動藥材種植業、中蒙醫藥知識經濟等相關產業發展。