Box-Behnken響應面法優選蓮子超微粉碎制備工藝*

張艷軍，劉曉琴

（1.山西省晉城市中醫醫院籌建事務中心，山西 晉城048000；2.山西中醫藥大學，山西 晉中030619）

蓮子為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥成熟種子，主要含有蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿等生物堿類、黃酮類、糖類成分［1-3］，具有補脾止瀉、止帶、益腎澀精、養心安神功效［4］，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗心律失常、降血壓、改善心血管功能等作用［5］，廣泛用于中醫藥、保健食品開發、日化用品研發中，市場開發前景巨大［6］。蓮子入藥通常需粉碎成細粉，而傳統粉碎方法制備的蓮子細粉藥效成分溶出不完全，影響臨床療效。超微粉碎技術是指利用機器或流體動力將0.5～5.0 mm的物料顆粒粉碎至微米甚至納米級（5～25 nm）的過程。使用常規粉碎技術所得物料粒徑只能達45 μm，而運用超微粉碎技術能使物料粒徑達10 μm，甚至1 μm，得到超細粉體。經超微粉碎后，顆粒狀物料可在一定程度上提升超微粉的吸附性、溶解性、分散性，有助于營養成分的溶出、機體的消化吸收及物質的充分利用［7］；且超微粉碎工藝通常在低溫下進行，對于遇高溫易分解的有效成分具有一定保護作用［8］。中藥經超微粉碎技術處理后，植物細胞壁多數破裂，分布其中的中藥活性成分得以暴露，縮短了發揮療效的時間，提高了生物利用度，減少了用藥量，間接節約了中藥材資源［9-10］。由于超微粉碎技術應用時間不長，在中藥領域的應用中，工藝質量控制是亟需解決的一大難題［11］。同時，由于物料本身的性質及制備過程中受多種因素影響，需對不同類藥材的粉碎規律進行深入研究［12］。在單因素試驗基礎上，響應面法可連續分析試驗的各個水平，且試驗結果的精度和真實度均高，直觀性強［13］。本研究中以蓮子超微粉累計粒度分布百分數達到50%對應的粒徑（D50）為評價指標，考察粉碎時間、烘干時間、初始粉碎粒度對蓮子超微粉粒徑的影響，采用Box-Behnken響應面法優選蓮子超微粉的制備工藝，并將最佳工藝制得的蓮子超微粉進行薄層鑒別及水分、總灰分測定?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DE-200g型萬能高速粉碎機（鞏義市予華儀器有限責任公司）；GZX-9140MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；SB-5200DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為240 W，頻率為40 kHz）；AX224ZH/E型電子天平（奧豪斯儀器＜常州＞有限公司，精度為萬分之一）；馬爾文Zetasizer Nano S90型納米粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；SQW-6QI型三清易辰細胞破壁超微粉碎機（濟南易辰超微粉碎技術有限公司）。

1.2 試藥

丙酮（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20190120）；正己烷（批號為20190108），無水乙醇（批號為20190210），硫酸（批號為20190210），均購自天津市天力化學試劑有限公司；香草醛（天津市光復精細化工研究所）；蓮子對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號為YJ-121121）；蓮子（山西和仁堂中藥飲片有限責任公司，批號為180801），經山西省晉城市中醫醫院籌建事務中心張艷軍主管中藥師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 超微粉碎方法

利用高速粉碎機對蓮子進行粗粉碎，分別過2，3，4，5，6號篩后得到蓮子粉末，再分別置細胞破壁超微粉碎機中，設置不同粉碎參數進行相應粉碎，備用。

2.2 單因素試驗［14-15］

粉碎時間：在過2號篩、烘干0 h的條件下，探討藥材粉碎2，3，4，5，6 min對D50的影響?？梢?，當粉碎時間為4 min時D50最大，原因可能是隨著粉碎時間的增加，粗粉的細胞壁被完全打開，溶出水溶性大分子增多，由此暴露出更多親水基團，造成粘連，形成團聚體，使粉體的數量減少。故選擇粉碎2，3，4 min進行響應面試驗，詳見圖1 A。

烘干時間：以含水量為評價指標進行考察，將蓮子粗粉碎粉末過2號篩（24目），分裝于烘干至恒重的稱量瓶中，于60℃溫度下分別烘0，1，2，3，4，5，6，7 h，取出，置105℃烘箱中烘干至恒重，干燥箱中冷卻，測定烘干前后的質量，計算含水量［15］。結果烘干0，1，2，3，4，5，6，7 h的含水量分別為9.92%，5.89%，3.16%，2.79%，2.34%，2.02%，1.75%，1.88%。可見，隨著烘干時間的延長，含水量逐漸下降，為確保試驗的可研究性和準確性，選取烘干0，1，2，3，4 h進行單因素試驗。在粉碎3 min、過2號篩的條件下，探討藥材烘干0，1，2，3，4 h對D50的影響?？梢?，當烘干1～3 h時D50呈上升趨勢，原因可能是隨著烘干時間的延長，原料藥水分流失逐漸增大，超微粉碎效果越好。當烘干1 h時分子粒徑突然減少，隨后再度增大，是一個可研究的轉折點。故選擇烘干0，1，2 h進行響應面試驗，詳見圖1 B。

A.粉碎時間B.烘干時間C.初始粒度圖1單因素試驗結果A.Grinding time B.Drying time C.Initial granule sizeFig.1 Results of the single-factor test

初始粒度：在粉碎3 min、烘干0 h的條件下，探討藥材過2，3，4，5，6號篩對D50的影響?？梢?，隨著篩號的增加，超微粉的D50呈現先增大后減小再增大的趨勢，從過5號篩（80目篩）起D50急劇增大。故選擇過4，5，6號篩進行響應面試驗，詳見圖1 C。

2.3 Box-Benhnken響應面試驗優化工藝參數

因素與水平：基于單因素試驗結果，以粉碎時間（因素A）、烘干時間（因素B）、初始粒度（因素C）為考察因素，以蓮子超微粉溶液的D50為響應值，進行三因素三水平響應面試驗。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

試驗設計與結果：依據Box-Benhnken響應面試驗設計原理，采用Design-Expert V 8.0.6軟件分析，設計出三因素三水平共17組試驗。試驗設計與結果見表2。

表2 Box-Benhnken響應面試驗設計與結果Tab.2 Design and results of the BBD-RSM

方差分析：采用Design-Expert V 8.0.6軟件對蓮子超微粉碎制備工藝的試驗數據進行分析，得到響應值D50對烘干時間、粉碎時間、初始粒度的二次多元回歸模型方程Y=1 270.387 50-303.625 00A-240.450 00B-205.400 00C+32.225 00AB-0.975 00AC+0.825 00BC+47.437 50A2+66.987 5B2+22.437 5C2。方差分析結果見表3，P＜0.05為對結果有顯著影響，P＜0.01為對結果有極顯著影響?；貧w模型F=18.070，P=0.000 5＜0.01，表明二次多元回歸模型顯著；模型決定系數R2=0.958 7，表明該模型對實際值的模擬效果良好，試驗誤差??；一次項C、交互項AB及二次項A2，B2，C2對超微粉碎的效應均顯著。

表3 方差分析結果Tab.3 Results of the ANOVA

響應面分析：采用Design-Export 8.0.6軟件分析得兩因素交互作用對蓮子超微粉D50影響的響應面等高線圖和三維圖（圖2）?？梢?，當A=2.88、B=1.07、C=4.62時蓮子超微粉碎效果最佳，預測得蓮子超微粉D50為706.67 nm。考慮到實際操作，確定最佳工藝為原藥材粉碎3 min，過5號篩，60℃烘干1 h。

驗證試驗：按優選工藝制得3批蓮子超微粉，測得其D50分別為707，714，710 nm，平均（710.33±2.87）nm，與預測值706.67 nm接近，說明Box-Benhnken響應面法對超微粉碎工藝擬合效果好。

2.4 質量標準研究

薄層色譜鑒別：取蓮子對照藥材粉末5 g，加三氯甲烷30 mL，搖勻，放置過夜，濾過，濾液蒸干，殘渣用2 mL乙酸乙酯使溶解，得對照藥材溶液。按優選工藝制備10批蓮子超微粉，分別取5 g，按對照藥材溶液制備方法制備供試品溶液。吸取對照藥材溶液、供試品溶液各2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-丙酮（7∶2，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛-10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，于365 nm波長紫外光燈下觀察。供試品溶液與對照藥材溶液的色譜圖相應位置上顯相同顏色的熒光斑點。色譜圖見圖3。

水分、總灰分測定：取薄層色譜鑒別項下10批（編號為1～10）蓮子超微粉，依據2020年版《中國藥典（四部）》通則0832水分測定法和通則2302灰分測定法測定水分和總灰分。結果蓮子超微粉中水分為5.41%～8.10%，平均6.55%；總灰分為2.67%～4.76%，平均4.07%。詳見表4。

表4 蓮子超微粉水分和總灰分測定結果（%）Tab.4 Results of content determination of moisture and total ash of Nelumbinis Semen Ultrafine Powder（%）

3 討論

中藥超微粉技術是在中醫藥理論基礎上，結合中藥材自身特點，將飲片進行超微粉化的新型技術。藥材經超微粉化處理后，能提高其有效成分的溶出率和生物利用度，增強藥效［9，12，16-20］。蓮子為藥食兩用藥材，具有降壓、抗心律失常、抗氧化、神經保護、抗炎等作用，臨床廣泛用于治療糖尿病、阿爾茨海默?。?1］、非小細胞肺癌［22］、高血壓［23］等。中藥超微粉碎技術的應用，使蓮子在發揮藥效作用的基礎上，實現了攜帶便利、服用方便、生物利用度好的優點，對于提升蓮子產業價值、開發蓮子新食品、拓寬深加工途徑具有重要意義，同時可促進蓮子精深加工產業及中藥超微粉產業的健康、可持續發展，提升中醫藥的世界認可度。

A.粉碎時間-初始粒度B.烘干時間-初始粒度C.粉碎時間-烘干時間圖2兩因素交互作用對蓮子超微粉D50影響的響應面等高線圖和三維圖A.Grinding time-initial granule size B.Drying time-initial granule size C.Grinding time-drying timeFig.2 Contour diagrams and three-dimensional diagrams of response surface of the effects of two-factor interaction on the D50 of Nelumbinis Semen Ultrafine Powder

1.對照藥材溶液2-11.供試品溶液圖3蓮子超微粉薄層色譜圖1.Reference medicinal materials solution 2-11.Test solutionFig.3 TLC chromatograms of Nelumbinis Semen Ultrafine Powder

本研究中采用Box-Behnken響應面法優化的蓮子超微粉碎最佳工藝為，原藥材粉碎3 min，過5號篩，60℃烘干1 h。按最優工藝條件制備的蓮子超微粉的平均D50為（710.33±2.87）nm，且薄層色譜顯色清晰，分離度好，專屬性強，為制訂蓮子相應的質量標準提供了參考。