Box-Behnken響應面法優化止咳祛痰糖漿中桔梗皂苷D提取工藝*

江凱航，劉東升，朱旭江

（1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州730070；2.國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室，甘肅 蘭州730070）

止咳祛痰糖漿具有潤肺祛痰、止咳定喘功效，臨床用于治療傷風咳嗽、慢性支氣管炎及支氣管哮喘。方中，桔梗為君藥，有宣肺、利咽、祛痰作用，皂苷類化合物為主要活性成分和特征性成分［1］。研究證實，桔梗皂苷D是桔梗提取物中的主要活性化合物［2］。為了確保產品質量，保證臨床用藥安全、有效，對制劑中桔梗皂苷D進行定量研究。桔梗皂苷與其他皂苷之間極性相近，測定其含量時，可用正丁醇提取，優選其最佳提取工藝，常采用正交試驗或響應面法確定提取工藝的參數。其中，正交試驗無法獲得設計變量的最優組合和響應目標的最優值，當試驗因素具有較多水平數時需進行大量試驗，實施較困難。響應面法的試驗次數少，試驗周期短，精密度高，求得回歸方程精度高，預測性能好，能研究幾種因素間的交互作用，只要確定合理的影響因素與水平［3］，即能得到較好的優化結果。本研究中以提取次數、洗滌溶劑、洗滌溶劑體積為考察因素，以桔梗皂苷D含量為評價指標，采用Box-Behnken響應面法優化止咳祛痰糖漿中桔梗皂苷D的提取工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；MS205DU型分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

桔梗皂苷D對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111851-201708，含量為97.9%）；止咳祛痰糖漿（康縣獨一味生物制藥有限公司，批號分別為2001056001，2001057001，2001058001，2003057001，2003058001，2003061001，2006056001）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 桔梗皂苷D含量測定方法建立

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：YMC HPLC Column C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：蒸發光散射檢測器（ELSD）；流動相：乙腈-水（28∶72，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：5，20 μL（對照品溶液），20 μL（供試品溶液）。理論板數按桔梗皂苷D峰計應不低于3 000。

2.1.2 溶液制備

取桔梗皂苷D對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為0.497 5 mg/mL的桔梗皂苷D對照品溶液。

取樣品10 mL，加水20 mL，搖勻，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次30，30，20，20，20 mL，合并正丁醇液；用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次30 mL，合并氨試液；再用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次15 mL，合并正丁醇液。回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，定量轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

按處方比例及制備工藝制備不含桔梗的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：吸取2.1.2項下3種溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖相同保留時間處有色譜峰出現，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：分別精密吸取2.1.2項下對照品溶液（質量濃度為0.497 5 mg/mL）8，10，15，25，30，40 μL，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=362 965X-838 129，R2=0.999 0，（n=6）。結果表明，對照品溶液進樣量在3.980 2～19.901 1 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限與檢測限確定：取線性關系考察項下對照品溶液（質量濃度為3.980 0 mg/mL）適量，用甲醇逐級稀釋，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比（S/N）為3∶1時，計算得待測成分的檢測限為0.199 0 mg/mL；當S/N為10∶1時，計算得待測成分的定量限為0.796 0 mg/mL。

精密度試驗：取2.1.2項下對照品溶液（質量濃度為0.497 5 mg/mL）20 μL，按2.1.1項下色譜條件連續進樣測定6次。結果峰面積的RSD為2.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為2003061001）適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，取20 μL，分別于0，4，6，8，12，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果峰面積的RSD為1.65%（n=6），表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號為2003061001）適量，共6份，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果含量的RSD為1.46%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為2003061001）5 mL，共6份，分別加入對照品溶液（質量濃度為0.497 5 mg/mL）各1 mL，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算含量。結果見表1。

2.2 桔梗皂苷D提取方法優化

2.2.1 單因素試驗

提取次數：取樣品（批號為2003061001）10 mL，共6份，加水20 mL，搖勻，用水飽和的正丁醇分別振搖提取4次（每次30，30，20，20 mL），5次（每次30，30，20，20，20 mL），6次（每次30，30，20，20，20，20 mL），各2份，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次30 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，定量轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算桔梗皂苷D含量。結果用水飽和的正丁醇提取4次、5次、6次的提取液中桔梗皂苷D的平均含量分別為0.90，0.91，0.90 mg（n=3），故選擇水飽和的正丁醇提取5次，每次30，30，20，20，20 mL。

洗滌溶劑：取樣品（批號為2003061001）10 mL，共6份，加水20 mL，搖勻，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次30，30，20，20，20 mL，合并正丁醇液，分別用氨試液、正丁醇飽和的氨試液、正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，各2份，正丁醇液回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，定量轉移至5 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算桔梗皂苷D含量。結果上述各洗滌溶劑中桔梗皂苷D的含量分別為0.91，1.12，0.92 mg（n=3），故選擇正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次30 mL。

洗滌溶劑體積：取樣品（批號為2003061001）10 mL，共6份，加水20 mL，搖勻，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次30，30，20，20，20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次30 mL，用水飽和的正丁醇分別振搖提取0次、1次、2次，每次15 mL，各2份，合并氨試液或正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，定量轉移至5 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算桔梗皂苷D含量。結果上述各洗滌溶劑中桔梗皂苷D的含量分別為1.23，1.25，1.26 mg（n=3），故選擇用水飽和的正丁醇洗滌2次，每次15 mL。

2.2.2 Box-Behnken響應面試驗

試驗設計與結果：在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken模型設計試驗，以提取次數（因素A）、洗滌溶劑（因素B）、洗滌溶劑體積（因素C）為自變量，以10 mL洗滌溶劑中桔梗皂苷D含量為響應值（Y）進行響應面分析，確定最佳提取工藝條件。因素與水平見表2，試驗設計與結果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

表3 Box-Behnken響應面試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the BBD-RSM

結果分析：采用Design-Expert.V8.0.6軟件進行回歸分析，并進行二項式擬合和多元線性回歸分析，得二次多項回歸方程Y=1.25+0.019A-0.010B+0.056C+0.020AB-7.500E-003AC-0.015BC-0.038A2-0.250B2-0.028C2。為驗證方程的有效性，對桔梗皂苷D提取的數學模型進行方差分析，P＜0.05為影響顯著，P＜0.01為影響極顯著，方差分析結果見表4。可見，模型P＜0.000 1，表明該回歸模型達到了極顯著水平；失擬項P=0.751 0＞0.05，表明該失擬項不顯著；二項式擬合相關系數R2=0.999 7，表明本次試驗選擇二項式擬合模型為成功模型；模型的修正相關系數R2Adj=0.999 2，表明預測值和實測值基本吻合，預測性良好［4］，該擬合方程能準確反映提取次數、洗滌溶劑、洗滌溶劑體積對桔梗皂苷D含量的影響，一次項、交互項和二次項均達到極顯著水平，故該模型可用于分析與預測止咳祛痰糖漿中桔梗皂苷D的提取工藝。

表4 方差分析結果Tab.4 Results of ANOVA

響應面分析：采用Design-Expert.V8.0.6軟件對試驗結果進行分析，得到桔梗皂苷D含量與各因素交互作用的三維響應面圖（圖2）。可見，桔梗皂苷D含量與提取次數、洗滌溶劑、洗滌溶劑體積間的交互作用明顯，與方差分析結果一致。

2.2.3 試驗結果驗證

利用Design Expert軟件結合Box-Behnken響應面試驗，制備了數學模型，得到最優提取工藝參數，即用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次30，30，20，20，20 mL；用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次15 mL。按此優選工藝制備3批樣品，測得每10 mL樣品中桔梗皂苷D的平均含量為1.264 8 mg，與理論值接近，表明該模型可靠。

3 討論

3.1 檢測器選擇

在對桔梗皂苷的研究中發現，高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLC-ELSD）法［5］和反相高效液相色譜（RP-HPLC）法［6］等應用較廣。桔梗皂苷D無共軛結構，無強的發色基團，末端吸收檢測干擾較大［6］，故紫外檢測器并非桔梗皂苷D的最佳檢測儀器。參考文獻［7-9］，最終采用HPLC-ELSD法。

3.2 供試品溶液制備方法考察

參考2020年版《中國藥典（一部）》桔梗（50%甲醇提取后過硅膠柱）、桔梗冬花片和甘桔冰梅片（50%甲醇提取后正丁醇萃取）中桔梗皂苷D的含量測定方法，當歸補血口服液（直接用正丁醇萃取）、芪冬頤心口服液（直接用正丁醇萃取）中皂苷類成分黃芪甲苷的含量測定方法，以及文獻［10-11］中報道的桔梗皂苷D的含量測定方法，并結合桔梗藥材和制劑制法項下桔梗藥材的入藥方式，最終確定為本供試品溶液制備方法。

A.洗滌溶劑-提取次數B.洗滌溶劑-洗滌溶劑體積C.提取次數-洗滌溶劑體積圖2各因素交互作用對桔梗皂苷D含量影響的響應面三維圖A.Washing solvent-extraction times B.Washing solvent-washing solvent volume C.Extraction times-washing solvent volumeFig.2 Three-dimensional diagrams of response surface of the effects of the two-factor interaction on the content of platycodin D

3.3 方法評價

本研究中建立了桔梗皂苷D含量測定的HPLCELSD法，并通過單因素試驗和Box-Behnken響應面法優選了止咳祛痰糖漿中桔梗皂苷D的最佳提取方法，結果直觀、可靠，能將止咳祛痰糖漿中桔梗皂苷D基本提取完全。