Box-Behnken響應面法優選土茯苓七味湯提取工藝*

耿宏俠，王宇佳，于英杰，吳亞男，張新悅，嚴德康，郭睿博，李學濤，程 嵐

（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連116600）

土茯苓七味湯是蒙醫傳統藥方，出自蒙醫經典著作《珊瑚驗方》［1］，別名陶匹浪-7，由土茯苓、金銀花、訶子、川楝子、梔子、黃連、瞿麥7味中藥材共研成細末制成湯劑［2］，主治血熱引起的頭痛、咽喉腫痛、面部皰疹、經血淋漓等諸血癥。方中，君藥土茯苓清熱，性平，味甘淡，歸肝、胃經，有除濕、解毒、通利關節功效；金銀花、黃連、瞿麥和梔子清血熱，為臣藥；配以訶子和中，調理體質，川楝子祛巴達干、希拉，為佐使藥。諸藥合用，效力更佳［3-4］。濕疹為常見炎性皮膚病，臨床采用抗菌藥物、激素、抗組胺藥等治療，對于疼痛、瘙癢有緩解作用，但易復發，長期應用易引發多種藥品不良反應，且易產生依賴性。中醫藥治療濕疹副作用小，復發率低，效果佳，可選擇中藥湯劑、中成藥、外用中成藥、中藥提取物，以及中藥塌漬療法、中藥藥浴療法、中藥熏蒸療法等中醫特色療法［5-6］。土茯苓七味湯為蒙醫經典方，臨床應用廣泛，治療血熱引起的面部皰疹和皮膚濕疹的療效顯著。目前，中藥復方提取工藝的優化方法有正交試驗［7］、Box-Behnken響應面法［8］等。本研究中選擇落新婦苷含量、干膏得率作為主要考察指標，并結合Box-Behnken響應面法優化土茯苓七味湯的提取工藝，為其后續研究提供試驗數據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FA1004型電子天平（上海越平科學儀器有限公司，精度為0.1 mg）；B220型電熱恒溫水浴鍋、DZF型真空干燥箱（北京市永光明醫療儀器有限公司）；20AT型液相色譜儀（日本島津公司），配有紫外檢測器。

1.2 試藥

落新婦苷對照品（大連美侖生物技術有限公司，批號為29838-67-3，純度大于98%）；冰醋酸、甲醇、乙醇均為分析純，水為純凈水；土茯苓（產地廣西，批號為210301），訶子（產地廣東，批號為210115），梔子（產地河南，批號為210101），川楝子（產地安徽，批號為210103），黃連（產地四川，批號為210313），瞿麥（產地河北，批號為201101），均購自安徽道源堂中藥飲片有限公司；金銀花（亳州市康易飲生物科技有限公司，產地安徽，批號為210310）。上述中藥材均經遼寧中醫藥大學藥學院許亮教授鑒定為正品，符合2020年版《中國藥典（一部）》相關項下要求。

2 方法與結果

2.1 干膏得率測定

按處方比例精密稱取土茯苓、金銀花、訶子、梔子、川楝子、黃連、瞿麥7味藥材共41 g，置圓底燒瓶中，加入適量乙醇，回流提取3次，濾過，合并濾液，濃縮濾液，置坩堝中，65℃減壓干燥至恒重，計算干膏得率。

2.2 落新婦苷含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸溶液（36∶64，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：291 nm［9］。

2.2.2 溶液制備

取落新婦苷對照品0.2 mg，精密稱定，加60%甲醇1 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得對照品溶液。按處方比例精密稱取土茯苓、金銀花、訶子、梔子、川楝子、黃連、瞿麥7味藥材共41 g，置圓底燒瓶中，加入適量乙醇，回流提取3次，濾過，合并濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按處方比例精密稱取缺土茯苓的其余6味藥材，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取2.2.2項下3種溶液各適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果分離度良好，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：取落新婦苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成質量濃度分別為0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0 mg/mL的系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以落新婦苷質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1 E+07X+98 409，R2=0.999 1（n=6）。結果表明，落新婦苷質量濃度在0.1～3.0 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限和檢測限確定：取對照品溶液，用甲醇逐級稀釋，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1的質量濃度計算檢測限和定量限。結果落新婦苷的檢測限為0.23 μg/mL，定量限為0.76 μg/mL。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μL，按2.2.1項下色譜條件在同1 d內連續進樣測定6次，計算日內精密度；連續測定3 d，每天2次，計算日間精密度。結果日內精密度和日間精密度的RSD分別為0.97%和1.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品，精密稱定，按Box-Behnken試驗3號方案平行制備供試品溶液6份，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.28%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品，精密稱定，按Box-Behnken試驗3號方案制備供試品溶液，于室溫放置0，4，8，12，16，24 h，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.20%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取樣品，精密稱定，按Box-Behnken試驗3號方案平行制備供試品溶液6份，按1∶1的比例加入對照品溶液（質量濃度為2 mg/mL），按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果落新婦苷的平均加樣回收率為99.33%，RSD為1.89%（n=6），表明方法準確度良好。

2.3 提取工藝優選

2.3.1 試驗設計

應用三因素三水平的Box-Behnken響應面法評估和優化過程變量的影響，以乙醇體積分數（因素A）、乙醇用量（因素B）、提取時間（因素C）作為影響因素。考慮提取次數為非連續變量，難以進行回歸處理，結合相關文獻初步設定為3次，各因素設3個水平，分別用-1，0，1表示［10］，因素與水平見表1。以落新婦苷含量和干膏得率的總評歸一值（OD）為評價指標，落新婦苷含量為主要指標，權重系數設為0.8；干膏得率為次要指標，權重系數設為0.2。試驗設計與結果見表2，計算公式如下［11-13］。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Tab.2 Design and results of the BBD

A.供試品溶液B.對照品溶液C.陰性對照品溶液圖1高效液相色譜圖1.AstilbinA.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

式（1）中，Ymax為指標最大值，Ymin為指標最小值，Yi為指標i測定值，di為落婦新苷含量歸一值；式（2）中，d1為落新婦苷含量歸一值，d2為干膏得率歸一值。

2.3.2 模型擬合與方差分析

使用Design-Expert V8.0.6統計軟件，以OD為因變量對各因素進行二次多項式擬合，得擬合方程Y=0.92+0.081A+0.023B+0.17C-0.014AB+0.075AC+9.500E-003BC-0.49A2-0.15B2-0.23C2（r=0.994 2，P＜0.05）。P＜0.05為對結果有顯著影響，P＜0.01為對結果有極顯著影響［14］。方差分析結果見表3。可見，回歸模型P＜0.000 1，表明回歸模型顯著；各因素影響程度由大至小依次為因素C＞因素A＞因素B，即提取時間＞乙醇體積分數＞乙醇用量，其中A，C，A2，B2，C2對結果有極顯著影響（P＜0.01），AC對結果有顯著影響（P＜0.05），B，AB，BC對結果的影響不顯著（P＞0.05）。

表3 方差分析結果Tab.3 Results of the ANOVA

2.3.3 工藝條件優化與預測

各因素對OD影響的三維響應面圖和二維等高線圖見圖2。可見，因素B對OD的影響較小，因素A和因素C對OD的影響顯著；上述交互因素中，因素A與因素C的響應面形狀較陡峭，等高線呈橢圓形，表明因素A與因素C的交互作用更明顯。利用Design-Expert V8.0.6統計軟件預測出的最優提取工藝為加8.16倍量62.2%乙醇，提取3次，每次101.52 min，OD的預測值為0.955 3。

2.4 驗證試驗

通過Box-Behnken響應面法得到了最優提取工藝，為方便試驗操作，將提取條件調整為加8倍量60%乙醇，提取3次，每次90 min，進行3次驗證試驗。結果OD的預測值為0.955 3，實測值分別為0.952 1，0.924 5，0.938 7，平均為0.938 4，與預測值的相對偏差為1.76%（＜5%），表明所建立的模型預測性良好。

3 討論

參照2020年版《中國藥典（一部）》土茯苓含量測定項下色譜條件，以甲醇-0.1%冰醋酸溶液（39∶61，V/V）為流動相［9］，考察色譜分離情況，結果落新婦苷色譜峰與其他雜質色譜峰分離效果不理想；后以甲醇-0.1%冰醋酸溶液（36∶64，V/V）為流動相，結果落新婦苷色譜峰分離度良好，保留時間適宜，理論板數較高，在本試驗確定的色譜條件下，理論板數按落新婦苷峰計不低于5 000。故確定流動相為甲醇-0.1 %冰醋酸溶液（36∶64，V/V）。本研究中采用高效液相色譜法測定土茯苓七味湯中落新婦苷的含量，方法學考察結果均良好。該方法簡便快捷、靈敏度高、準確可靠、適用性強，可用于落新婦苷的含量測定。

A.乙醇體積分數-乙醇用量B.乙醇體積分數-提取時間C.乙醇用量-提取時間圖2兩因素交互作用對總評歸一值影響的響應面三維圖和等高線圖A.Volume fraction of ethanol-amount of ethanol B.Volume fraction of ethanol-extraction time C.Amount of ethanol-extraction timeFig.2 Three-dimensional diagrams and contour diagrams of response surface of the effects of the two-factor interaction on the OD

Box-Behnken響應面法可連續分析試驗的各個水平，找到整個區域中因素的最佳組合和響應的最優值。相較于正交設計法和均勻設計法，試驗次數少，試驗精度高，所得結果更合理可靠、清晰直觀，但其局限性為最優條件要在設計的因素水平范圍內［15］。本研究中確定了土茯苓七味湯的最優提取工藝為加8倍量60%乙醇，提取3次，每次90 min。與文獻［16-17］優選工藝相比，所得落新婦苷提取率較高，且實測值與預測值相符，表明Box-Behnken響應面法優選得到的提取工藝可靠，具有一定的實際應用價值，可為土茯苓七味湯的后續研究提供參考。