HL-5抑制HCT116細胞增殖作用及作用機制*

鄒麗娟，鄭 莉，萬 丹，甘 萍△

（1.中國人民解放軍西部戰區總醫院，四川 成都610083；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都610041）

目前，大多數基于“單靶點單藥物”模型的藥物，在治療復雜、異質、多基因的疾病如腫瘤方面正變得越來越無效。雖然藥物組合療法被用作實現療效的替代方法，但其優勢往往被不利的藥物-藥物相互作用、不可預測的藥代動力學和安全性及患者服藥依從性差所抵消。近年來，更傾向于研發“多靶點藥物”，以解決許多單靶點或聯合療法的有限療效和耐藥性或毒性。磷脂酰肌醇3-羥基激酶（PI3K）和組蛋白去乙酰化酶（HDAC）是目前臨床應用較廣泛的抑瘤靶點，但PI3K和HDAC抑制劑都受到療效不足和耐藥突變的限制。有證據表明，同時抑制PI3K和HDAC，可協同抑制腫瘤生長，并通過提高療效、限制耐藥性和提供比單一抑制劑更好的治療窗口來克服這些限制［1］。特異性HDAC和PI3K異構體的選擇性抑制劑可能具有更好的低毒性特征，治療窗更寬。治療彌漫大B細胞淋巴瘤的雙重抑制劑CUDC-907可通過協同效應抑制腫瘤細胞增殖和生存補償途徑，表現出HDAC和PI3K雙向抑制作用，獲得更好的治療效益［2］。臨床迫切需要新的具有高效力和選擇性的雙重抑制劑［3-4］。為此，本研究中以半數抑制率（IC50）評價HL-5與陽性藥物辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA，HDAC靶點抑制劑）和4-羥基-2，6-二甲基苯甲腈（GDC-0941，PI3K靶點抑制劑）對腫瘤細胞增殖的抑制效果，同時通過細胞克隆實驗、流式細胞儀和蛋白免疫印跡（Western blotting）法，探討HL-5抑制腫瘤細胞增殖的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：Multiskan Spectrum-15型全波長酶標儀，SORVALLST 16型常溫離心機，FASC420型流式細胞儀，均購自賽默飛世爾科技有限公司；CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CCL-170B-8型CO2細胞培養箱（新加坡ESCO公司）。

試藥：HL-5由課題組自主設計、合成，化學結構見圖1。SAHA（批號為J01764A），GDC-0941（Pictilisib，批號為J0315A），均購自大連美侖生物技術有限公司；四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Sigma公司，批號為EZ7890D354）；p-H3（批號為17AV0305），cdc25c（批號為E1616），P21（批號為F036118），p-cdc2（批號為K012443），均購自Abcam公司。

圖1 HL-5的設計、合成與化學結構Fig.1 Design，synthesis and chemical structure of HL-5

1.2 方法

IC

50測定：選取對數生長期細胞，按（3～5）×104個/孔鋪于96孔板，培養過夜。依次按濃度梯度加入HL-5（1 000，500，250，125，62.5，31.25 nmol/L），GDC-0941（20 000，10 000，5 000，2 500，1 250，625，312.5 nmol/L），SAHA（20 000，10 000，5 000，2 500，1 250，625，312.5 nmol/L），72 h后測定IC50［5］。

細胞克隆形成實驗：細胞接種于6孔板（1×105個/孔），24 h后用不同終濃度的HL-5（0，25，50，100，200，400 nmol/L）干預48 h；更換新的6孔板，完成干預后的細胞重接種（500個/孔），行單克隆集落培養12 d；將細胞用甲醇固定15 min，0.1%結晶紫染液染色10 min，晾曬，次日拍照［6-7］。

細胞周期的流式檢測：選用6孔板接種人結腸癌細胞系HCT116細胞（1×105個/孔），24 h后用不同終濃度的HL-5（0，40，200，1 000 nmol/L），SAHA（1 000 nmol/L），GDC-0941（1 000 nmol/L）干預細胞24 h；收集細胞，依次行清洗、固定、碘化丙啶（PI）染色和流式細胞儀檢測分析［8-9］。

Western blotting實驗：采用9 cm培養皿接種人結腸癌細胞系HCT116細胞，24 h后用不同終濃度的HL-5（0，40，200，1 000 nmol/L），SAHA（1 000 nmol/L），GDC-0941（1 000 nmol/L）干預細胞24 h；分別提取總蛋白，行電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、顯影和拍照。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗腫瘤細胞增殖活性

選取部分實體瘤細胞株進行考察，結果見表1。

表1 HL-5，SAHA，GDC-0941抗腫瘤細胞增殖活性比較（±s，μmol/L）Tab.1 Comparison of anti-proliferation effect of HL-5，SAHA and GDC-0941 on the tumor cells（±s，μmol/L）

表1 HL-5，SAHA，GDC-0941抗腫瘤細胞增殖活性比較（±s，μmol/L）Tab.1 Comparison of anti-proliferation effect of HL-5，SAHA and GDC-0941 on the tumor cells（±s，μmol/L）

注：與HL-5比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with those of HL-5，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

細胞株Hcc827 H1975 A549 MDA-MB-231 MCF-7 HCT116 COCO205 SW620 HT29 A2780s HepG2 HL-5 0.282±0.096 0.133±0.007 0.443±0.025 0.227±0.011 0.114±0.020 0.077±0.003 0.079±0.016 0.094±0.009 0.032±0.003 0.208±0.017 0.347±0.042 SAHA 0.843±0.044*0.305±0.015*1.808±0.026*0.823±0.033*0.474±0.018*2.316±0.102**3.585±0.089***5.631±0.157***1.133±0.068*4.348±0.135*3.505±0.096**GDC-0941 8.363±0.127**0.323±0.015*0.511±0.047*3.408±0.129***0.577±0.044*0.804±0.036*0.381±0.038*5.664±0.115***1.764±0.092*1.142±0.086*7.528±0.150**

2.2 對HCT116細胞克隆形成的影響

細胞克隆集落形成情況見圖2 A，HCT 116細胞計數統計結果見圖2 B，可見，HL-5從25 nmol/L濃度開始，與二甲基亞砜比較差異有統計學意義（P＜0.01）。結果表明，HL-5對腫瘤細胞具有持久殺傷能力。

2.3 對細胞周期的影響

HDAC抑制劑SAHA與PI3K抑 制劑GDC0941對細胞周期的作用效果不同，SAHA將細胞阻滯在G2/M期，而GDC-0941將細胞阻滯在G1期［8］。通過PI染色考察HL-5對細胞周期的影響，結果見圖3。可見，HL-5處理HCT116細胞24 h后，G2/M期細胞比值隨濃度增加而增加，且到達一定比值后不再增加，其阻滯細胞周期的結果與SAHA類似而不同于GDC-0941。

2.4 對細胞周期阻滯標志分子的影響

由圖4可知，蛋白水平的結果與細胞流式儀分析結果相似，HL-5對各標志蛋白的影響類似于SAHA而不同于GDC-0941。經HL-5處理后，p-H3和P21水平升高；同時，細胞從G2期至M期轉化的關鍵催化因子p-cdc2（161）和cdc25c水平降低。

圖4 HL-5對細胞周期相關蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of HL-5 on the expression level of cell cycleassociated proteins

3 討論

HDAC抑制劑作為抗腫瘤藥物的效用在腫瘤學中越來越受到重視，臨床不斷涌現不同HDAC靶點的藥物，治療效果明顯。但其適應證大多局限于血液學腫瘤，對實體瘤疾病的治療作用不佳。同時，單靶點藥物更易出現耐藥性。多靶點藥物有效劑量更低，療效更好，相比單靶點藥物不易產生耐藥性，能對多種不同腫瘤細胞產生抑制作用，給藥物開發設計及臨床患者帶來諸多益處［10-12］。由表1可知，作為HDAC/PI3K雙靶點抑制劑，HL-5在非小細胞肺癌、乳腺癌、結腸癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌等細胞株中均顯示出良好的腫瘤抑制效果，且均優于對應的單靶點藥物SAHA和GDC-0941，表明雙靶點藥物起效劑量更低，同時單一HDAC或PI3K靶點抑制劑的適用范圍更大。與以往的單靶點藥物聯用增敏劑的研究［13］相仿，如在頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）模型中，HDAC的泛抑制劑LBH589與PI3K泛抑制劑BKM120聯合使用，在體外和體內均有協同抗腫瘤作用。作為首個報道的HDAC和PI3K的雙靶點抑制劑［14］，CUDC-907已有5個項目處于臨床評價階段。在后期研究中，將選擇CUDC-907作為陽性對照，對比HL-5與其體內外抗腫瘤療效的差異。

A.克隆染色B.HCT116細胞計數統計注：與二甲基亞砜比較，**P＜0.01，***P＜0.001。圖2 HL-5對HCT116細胞克隆形成的影響A.Clone staining B.Statistics of HCT116 cell countNote：Compared with that of dimethyl sulfoxide，**P＜0.01，***P＜0.001.Fig.2 Effect of HL-5 on the clone formation of HCT116 cells

細胞克隆形成實驗可考察化合物對腫瘤細胞的持久、不可逆的影響，檢測經過化合物處理后的細胞在移除藥物后能否繼續保持增殖活性的能力。由圖2可知，HL-5對HCT116細胞克隆形成有很好的抑制效果，且呈現一定的劑量依賴關系。由圖3可知，上述結果可能與HL-5能將細胞周期阻滯在G2/M期有關。PI3K信號通路激活導致c-Myc和細胞周期蛋白D1的表達增加，細胞周期檢查點蛋白質P21和P27的活性降低，促進細胞周期進程和存活［15］；HDAC是細胞周期進程的關鍵調節劑，能促使腫瘤抑制基因P21和P27的表達增加。因此，同時抑制PI3K和HDAC可協同降低細胞周期蛋白D1的轉錄，并增加c-Myc的降解。針對CUDC-907的研究發現，其對c-Myc有很強的抑制作用，用于Myc依賴的彌漫大B細胞淋巴瘤和BRD-NUT融合陽性NUT中線癌均有很好的效果［16］。周期分析結果提示，雙靶點抑制劑HL-5對細胞周期阻滯標志分子p-H3，cdc25c，P21，p-cdc2（161）的表達均有影響，其對細胞周期的抑制作用更傾向于HDAC抑制劑SAHA，且有一定的量效關系，而非同時具備2個靶點對周期阻滯的特點，與已有單靶點抑制劑作用機制類似［17］。后期研究將進一步考察HL-5對p27，c-Myc，caspase等相關信號通路靶標的影響。

綜上所述，與HDAC或PI3K抑制劑相比，雙靶點抑制劑HL-5可較好地擴展藥物的適用范圍，起效劑量更低，值得進一步開發利用。后期研究將選擇HCT116，H1975，COCO205，MCF-7細胞株建立荷瘤小鼠模型，以考察HL-5在體內的抗腫瘤作用和作用機制，以及可能的毒性靶器官［18-20］。