載siRNA的PLGA-b-PEG納米粒制備及初步體外評價*

紀剛劍，林 雯，史瓊枝，李銀科

（1.湖北省武漢市第三醫院·武漢大學附屬同仁醫院，湖北 武漢430060；2.黃石愛康醫院，湖北 黃石435000；3.中國人民解放軍中部戰區總醫院，湖北 武漢430070）

全球第1個核糖核酸（RNA）干擾藥物patisiran（商品名Onpattro）于2018年10月8日獲得美國食品藥物管理局（FDA）批準上市［1］，小干擾核糖核酸（siRNA）目前已成為生物技術藥物研究領域的研究熱點。但裸露的siRNA易被血清中的核酸酶降解，且易被腎臟快速清除［2］。siRNA相對分子質量較大（約14 000），所攜帶的負電荷制約其穿越體內多種生物屏障［3］。因此，實現siRNA的有效遞送須構建高效的載體遞送系統。原癌基因c-myc的活性改變是啟動和維持細胞癌變狀態的重要因素，在體內正常環境下的表達是被嚴格控制的。研究表明，抑制c-myc基因可產生顯著的抗癌效果。針對性抑制c-myc基因的siRNA應用前景極好［4］。微泡與超聲技術相結合可提供一種非侵入式的藥物靶向遞送方法，通過增加腫瘤部位的血管通透性而提高藥物載體（微泡）的遞送效率［5］。但微泡被超聲激發破壞后，其中包載的藥物瞬間釋放完畢，難以實現藥物在靶部位的持續釋放［6］。聚乳酸-羥基乙酸共聚物-b-聚乙二醇（PLGA-b-PEG）是由聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和聚乙二醇（PEG）構成的雙單元共聚物，具有兩親性、生物相容易降解性、長循環性等特點。本研究中制備以PLGA-b-PEG為基質的納米粒，包載可抑制c-myc基因的siRNA（5′-AACGUUAGCUUCACCAACAUU-3′）作為模型藥物［7］。將該納米粒與微泡一同注入體內，納米粒和微泡將隨著血液循環流經腫瘤部位，在體外的局部定點超聲作用下，微泡發生的空化作用暫時打開腫瘤血管壁屏障，納米粒借機進入腫瘤部位釋放包載的siRNA；持續的局部超聲刺激可加快藥物在病灶部位的釋放速率，實現深部位腫瘤的siRNA定向、定速釋放。研究表明，在超聲波刺激誘導微泡的慣性空化作用下，腫瘤局部的血管通透性增加，搭載siRNA的PLGA-b-PEG納米粒更易透過血管壁，進入腫瘤部位釋藥［8］，可增強腫瘤部位對納米粒子的實體瘤高通透性和滯留效應（EPR），從而實現藥物的靶向遞送。目前，關于c-myc基因的siRNA遞送方案尚未見文獻報道。為此，本研究中探討了載siRNA的PLGA-b-PEG納米粒的制備工藝，并對其進行初步體外評價，以期為c-myc基因表達異常的相關實體瘤的基因治療提供參考。現報道如下。

1 儀器、試藥與細胞

1.1 儀器

RE52CS型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；3K15型冷凍離心機（美國Sigma公司）；AH100D型脂質體擠出器（加拿大Avestin公司）；JY92-ⅡD型細胞超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；7500型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；NanoWizarc?型原子力顯微鏡（德國JPK Instruments AG公司）；NICOMP 380ZLS型Zeta電位/粒度分析儀（美國Santa Barbara公司）；RF-5301型熒光分光光度計（日本島津公司）；Bio-rad680型酶標儀（美國伯樂公司）；Intelect?2776型超聲波治療儀（美國Chattanooge公司，頻率為1 MHz，功率為4.5 W）。

1.2 試藥

PLGA-b-PEG（LA/GA=50/50，相對分子質量為5 000，西安瑞喜生物科技有限公司，批號為BV2032）；siRNA和FAM-siRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司，批號均為20160613）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司，批號為20170118）；RPMI-1640培養基（批號為8119064），DMEM培養基（批號為8117167），均購于美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Sigma公司，批號為M-2128）；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 細胞

人乳腺癌細胞MCF-7與結腸癌細胞HT-29由軍事科學院軍事醫學研究院惠贈，分別傳代于第3代、第4代。

2 方法與結果

2.1 納米粒制備

采用復乳法制備納米粒［6］。取PLGA-b-PEG 100 mg，精密稱定，置30 mL燒杯中，加入10 mL二氯甲烷（含3%司盤-80，m/V）溶解基質材料，磁力攪拌，緩慢滴加2 mL siRNA液［2 μmol/mL，使用前15 min配制，由經焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的含亞精胺水溶液配制，氮磷比為15∶1］，冰浴條件下超聲乳化（功率為30 W，工作2 s，停止2 s）120 s制備初乳；將初乳倒入60 mL 1%吐溫-80（m/V）水溶液中，冰浴條件下超聲乳化（功率為100 W，工作2 s，停止2 s）120 s制備復乳；磁力攪拌4 h，揮盡有機溶劑，固化，0.45 μm聚碳酸酯膜濾過，超濾管（截留相對分子質量100 000）離心（3 000g）過濾純化，經DEPC處理的純化水洗滌3遍，所得混懸液密封儲存于4℃冰箱。將siRNA液換成FAM-siRNA液，同法制備FAM-siRNA納米粒。

2.2 理化表征

形態：分別采用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡對所制備的siRNA納米粒進行形態觀察［7］。取少量納米粒樣品，經蒸餾水適當稀釋，滴加于電鏡專用樣品銅網，1%磷鎢酸染色，自然干燥，采用透射電子顯微鏡進行形態觀察。另取納米粒樣品少量，用蒸餾水稀釋，滴加于云母片，自然干燥，采用原子力顯微鏡進行形態觀察。由圖1可知，制備的載藥納米粒基本形態均勻，外形為球形，粒子直徑為100 nm。

圖1 不同顯微鏡下siRNA納米粒形態觀察A.TEM B.AFM（fast）Fig.1 Morphological observation of nanoparticles loading the siRNA with different microscopes

粒徑分布和Zeta電位：采用Zeta電位/粒度分析儀測定。儀器參數設置，激光掃描波長639 nm，入射光與散射光的夾角90°，測定溫度23℃。由圖2可知，所制備納米粒的平均粒徑為（101.5±6.3）nm，多分散系數（PDI）為0.095±0.008，Zeta電位為-（31.7±4.5）mV。粒徑儀測定的粒徑結果與透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡的結果一致。

圖2 siRNA納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of nanoparticles loading the siRNA

包封率：用TE緩沖液［10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA］配制系列FAM-siRNA標準溶液（質量濃度為0.03～0.27 μg/mL），采用熒光分光光度法進行測定，設置儀器參數Ex/Em為490/515 nm［9］，以熒光強度（F）對樣品濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程F=0.449 11C+0.396 34（R2=0.999 7）。結果表明，FAM-siRNA濃度在2～20 nmol/L范圍內與熒光強度線性關系良好。冷凍干燥納米粒樣品混懸液，精密稱定，加入乙腈溶解，TE緩沖液稀釋，測定熒光強度，代入回歸方程，計算總體載藥量（L總）；用超濾管（截留相對分子質量100 000）離心（3 000g）分離納米粒懸液，測定游離的藥物量（L游），計算納米粒的包封率。包封率=（L總-L游）/L總×100%。結果FAM-siRNA納米粒的包封率為（57.6±4.8）%。

2.3 穩定性考察

取FAM-siRNA納米粒樣品懸液0.5 mL，置10 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，混合，密封，置4℃冰箱，第0天和制備后第30天取樣，測定粒徑、電位和包封率，考察4℃條件下的制劑穩定性［9］。結果在4℃條件下放置30 d，納米粒的粒徑為（103.3±5.7）nm，PDI為0.097±0.009，Zeta電位為-（32.5±5.2）mV，包封率為（55.2±5.7）%；4℃條件下第0天，粒徑為（101.5±6.3）nm，PDI為0.095±0.008，Zeta電位為-（31.7±4.5）mV，包封率為（57.6±4.8）%。可見，第0天與第30天測定結果基本一致，表明4℃環境下納米粒在PBS中的穩定性良好。

2.4 體外釋藥考察

采用透析袋法考察。精密量取樣品懸液1.0 mL，置透析袋（截留相對分子質量100 000）中，兩端夾緊，置100 mL PBS（pH 7.4）中，37℃恒溫搖床（轉速為75 r/min）振搖。平行配制12份，分為超聲組和未超聲組。超聲組在1 h時利用Intelect?2776型超聲波治療儀超聲（頻率為1 MHz，功率為1 W/cm2）處理20 min。分別于0，1，2，4，6，8，12，24，48 h時取樣，同時補加釋放介質［9］，參照包封率測定項下測定釋放的FAM-siRNA濃度，計算累積釋放率，繪制釋藥曲線。由圖3可知，納米粒在體外模擬條件下釋藥平穩、持續。前24 h的累積釋放量為載藥量的65%～75%，余下部分于后續24 h內基本釋放完畢。超聲組FAM-siRNA于處理后2 h的累積釋放量較未超聲組高10%，表明制備的納米粒具有一定的超聲刺激釋藥特性，結合聲敏微泡可能促進在靶部位的釋藥。

圖3 FAM-siRNA納米粒的體外釋藥曲線Fig.3 Profiles of drug release in vitro of FAM-siRNA nanoparticles

2.5 MTT法檢測載體對細胞增殖的影響

將MCF-7與HT-29細胞以1.0×104個/孔的密度分別接種于48孔板中，37℃及5%CO2的培養箱中培養24 h［10-11］。分別設立空白對照組（Blank）、超聲空白對照組（Blank+US）、siRNA組（siRNA）、空白納米粒組（Blank NP）、siRNA納米粒組（siRNA NP）、siRNA納米粒超聲組（siRNA NP+US）。加樣體積為25 μL，含藥組的每孔siRNA濃度為25 nmol/L。超聲處理（功率為1 W/cm2，頻率為1 MHz）siRNA NP+US。加樣后繼續培養60 h，棄去原培養液，加入培養液［含20 μL MTT（5 mg/mL）］200 μL培養4 h，棄去培養液，加入200 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解，采用酶標儀于540 nm波長處測定吸光度，計算細胞存活率。由圖4可知，載藥納米粒組（siRNA NP，siRNA NP+US）與其他組（Blank，Blank+US，siRNA，Blank NP）之間的（MCF-7，HT-29）細胞存活率有顯著差異（P＜0.05）；載藥納米粒組和其他組（MCF-7，HT-29）組內無顯著差異（P＞0.05）。從趨勢上看，siRNA的存活率略低于Blank，siRNA NP和siRNA NP+US均低于siRNA。

圖4 體外細胞活性（n=6）Fig.4 Cell viability in vitro（n=6）

3 討論

納米粒的基質材料PLGA-b-PEG具有兩親性，而siRNA親水性強，難以直接包裹進入納米粒的內部疏水區域，故本研究中采用復乳法制備納米粒，以提高藥物包封率。處方中采用了2種乳化劑，根據乳化劑的親水/親油平衡系數（HLB），親油性的司盤80（HLB=4.3）用于穩定初乳W/O，親水性的吐溫80（HLB=15.0）用于復乳W/O/W的穩定［12-13］。為了提高siRNA的穩定性和包封率，處方中的siRNA先用帶正電的亞精胺中和，再包載入納米粒，將減少乳化超聲過程中產生的熱量對siRNA的破壞，于冰浴條件下超聲乳化吸收多余熱量［14-16］。此外，為減少環境中核酸酶對藥物的降解作用，使用前均用RNA酶滅活劑DEPC對試驗器具進行預處理［9］。

考慮縮短制備工藝的過濾時間，本研究中采用0.45 μm濾膜進行初濾，超濾管進行納米粒的過濾純化，未采用脂質體制備中常用的100～200 nm濾膜進行過濾。納米粒的剛性比脂質體大，過膜阻力大于脂質體，故采用預過濾后再超濾。粒徑100 nm的納米粒常用于體內藥物的靶向遞送［17-19］，故選擇納米粒的粒徑為100 nm。試驗制備的空白納米粒的Zeta電位為-22 mV，而含siRNA的納米粒的Zeta電位為-31 mV，這可能與部分未包封的siRNA吸附在納米粒表面有關［20］。由于基質材料PLGA-b-PEG和模型藥物均帶負電，根據同種電荷相斥的原理，可能導致siRNA藥物在PLGA-b-PEG材料中的包封率較低。

由于目前直接測定樣品中siRNA含量的方法較復雜，本研究中采用標記后的FAM-siRNA代替siRNA進行包封率和釋放度的考察。但這種熒光標記的siRNA可能并不能完全反映實際的siRNA情況，最終應以凝膠電泳法測定結果為準［21］。由圖3可知，siRNA的釋放速率前快后慢，可能與在納米粒內部的藥物需通過一段時間的擴散才能釋放到粒子表面有關。在超聲作用下，超聲組FAM-siRNA于處理后2 h的累積釋放率較未超聲組高10%，提示超聲作用有助于藥物釋放。本研究中制備的納米粒在超聲作用下可加快藥物釋放，且具有緩釋效果，可確保載體在進入位點后持續釋藥一段時間，延長藥物的靶向治療效果。

由圖4可知，超聲作用、空白載體與游離的siRNA幾乎均不影響MCF-7和HT-29腫瘤細胞的活性，游離的siRNA對2種腫瘤細胞存在一定抑制作用，但無統計學差異。可能與游離的siRNA在培養基中易被降解，且穿透細胞膜的能力低有關。載有siRNA的納米粒可被細胞攝入，顯現出較強的細胞抑制作用。在超聲波作用下，siRNA NP+US顯現出較強的腫瘤細胞活性抑制作用，這可能與超聲波可臨時打開細胞膜屏障有關［22］。此外，預試驗中，細胞培養48 h時各組間的差異無統計學意義，而培養60 h才表現出顯著差異，提示細胞培養時長對結果有很大影響。

本研究中意圖構建的siRNA遞送策略是通過超聲刺激腫瘤局部的聲敏微泡產生空化作用而提高腫瘤部位的血管通透性，進而提高納米粒在腫瘤部位的EPR效應而進入靶部位釋放siRNA，涉及超聲波功率、頻率、作用時長及微泡的理化特性等因素。本研究結果僅限于載體的制備方法和初步的體外評價，后續研究將作深入探討。

綜上所述，PLGA-b-PEG包裹的siRNA納米粒具有超聲刺激靶向釋藥特性，在siRNA腫瘤靶向給藥應用方面具有較好的潛力。