丙泊酚在低氧條件下對胰腺癌細胞增殖和侵襲的影響及可能的機制△

戴勁，彭鐵立，余相地

1廣州醫科大學附屬第六醫院（清遠市人民醫院）消化內科，廣州醫科大學消化病研究所，廣東 清遠 511500

2貴州省人民醫院麻醉科，貴陽 550001

胰腺癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。2015年全球共411 600人死于胰腺癌，其在美國惡性腫瘤相關死亡最常見原因中居第四位[1]。目前胰腺癌的主要治療方式包括手術切除、放療、化療、姑息治療或多種方法聯合治療，然而其療效在很大程度上取決于腫瘤的臨床分期和個人健康狀況[2]。手術切除依然是胰腺癌最主要的治療方式，然而手術應激、免疫抑制和圍手術期內環境的改變為腫瘤細胞的轉移提供了有利條件，是術后腫瘤復發的關鍵因素[3]。研究表明，麻醉藥同樣可以誘導并參與腫瘤細胞的生理和病理過程，如細胞增殖、血管生成和細胞凋亡。一項回顧性研究表明，腫瘤患者手術期間以丙泊酚為基礎的全憑靜脈麻醉（total intravenous anesthesia，TIVA）比吸入性麻醉藥能夠顯著降低死亡率（15.6%vs22.8%）[4]。由此可以推測丙泊酚具有潛在的抗腫瘤作用。研究表明，丙泊酚可通過上調微小RNA（microRNA，miRNA）-328的表達抑制解整合素樣金屬蛋白酶8（a disintegrin and metalloproteinase domain 8，ADAM8）的表達，從而抑制胰腺癌細胞的增殖和轉移[5]。ADAM8在很多惡性腫瘤（包括骨肉瘤、結腸癌、胃癌和胰腺癌）中與腫瘤細胞的增殖、轉移和不良預后有關。考慮到實體瘤特征性的低氧微環境，低氧可以誘導ADAM8表達上調。ADAM8在侵襲性乳腺癌中的表達會促進腫瘤細胞的擴散和轉移[6]。在胰腺癌中，具有抗炎作用的巨噬細胞通過上調基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和ADAM8的表達促進腫瘤細胞的侵襲[7]。本研究通過體外實驗探討丙泊酚在低氧條件下對胰腺癌細胞增殖和侵襲的影響及其可能的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人胰腺癌細胞株Panc-1購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。將細胞置于含10%胎牛血清的DEME培養基中，37℃、5%CO2的培養箱中培養24 h后，將細胞隨機分為Hypo組（低氧）、Hypo+P組（低氧+10 μg/ml丙泊酚）和正常組（正常培養）。其中Hypo組和Hypo+P組在低氧培養箱中繼續培養，正常組在常規條件下繼續培養。

1.2 CCK 8法檢測細胞增殖能力

將處于對數生長期的細胞以104/孔接種于96孔培養板中。使用CCK8試劑盒檢測24、48、72 h細胞的增殖情況。采用酶標儀測定細胞在450 nm處的吸光度值并繪制細胞生長曲線。

1.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

參照說明書使用Corning Costar Transwell Cell Culture Inserts進行細胞侵襲實驗。丙泊酚或對照溶劑乙醇處理24 h后，加入無血清培養基，制成單細胞懸液，密度為1×105/ml。上層小室加入100 μl細胞懸液，下層小室加入培養基。12 h后應用4%的多聚甲醛固定液固定遷移的細胞，然后用結晶紫溶液染色15 min。采用熒光顯微鏡拍攝圖片。

1.4 蛋白質印跡法檢測ADAM 8蛋白表達情況

采用RIPA裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，取30 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完畢后半干法轉膜，將膠上的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上。采用5%的脫脂奶粉室溫封閉60 min。將1∶1000稀釋的一抗4℃孵育過夜，1∶1500稀釋的二抗室溫孵育120 min。采用Odyssey Imaging Systems顯影并保存圖像。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以β-actin為內參，計算ADAM8蛋白的相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丙泊酚對低氧條件下胰腺癌Panc- 1細胞增殖活性的影響

培養24、48、72 h，Hypo組胰腺癌Panc-1細胞的增殖活性均高于正常組和Hypo+P組，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（圖1、表1）

圖1 CCK 8法檢測不同組別胰腺癌Panc- 1細胞的增殖活性

表1 不同時間點不同組別胰腺癌Panc- 1細胞增殖活性的比較（）

表1 不同時間點不同組別胰腺癌Panc- 1細胞增殖活性的比較（）

注：*與Hypo組比較，P<0.05

組別正常組Hypo組Hypo+P組1.4±0.2*1.7±0.2 1.2±0.1*2.2±0.2*3.6±0.3 1.5±0.2*3.1±0.4*4.9±0.5 1.9±0.3*24 h 48 h 72 h

2.2 丙泊酚對低氧條件下胰腺癌Panc- 1細胞侵襲的影響

Hypo組胰腺癌Panc-1細胞侵襲數目多于正常組和Hypo+P組，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（圖2、表2）

圖2 Transwell實驗檢測不同組別胰腺癌Panc- 1細胞的侵襲能力

表2 不同組別胰腺癌Panc- 1細胞侵襲數目的比較（）

表2 不同組別胰腺癌Panc- 1細胞侵襲數目的比較（）

注：*與Hypo組比較，P<0.05

組別正常組Hypo組Hypo+P組侵襲細胞數目12.7±3.5*23.5±4.7 8.7±2.2*

2.3 丙泊酚對低氧條件下胰腺癌Panc- 1細胞中ADAM 8蛋白表達情況的影響

Hypo組胰腺癌Panc-1細胞中ADAM8蛋白相對表達量高于正常組和Hypo+P組，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（圖3、表3）

圖3 蛋白質印跡法檢測不同組別胰腺癌Panc- 1細胞中ADAM 8蛋白的表達情況

表3 不同組別胰腺癌Panc- 1細胞中ADAM 8蛋白相對表達量的比較（）

表3 不同組別胰腺癌Panc- 1細胞中ADAM 8蛋白相對表達量的比較（）

注：*與Hypo組比較，P<0.05

組別正常組Hypo組Hypo+P組1.6±0.5*2.2±0.7 1.3±0.4*ADAM8蛋白相對表達量

3 討論

以丙泊酚為基礎的TIVA對改善腫瘤手術患者的預后具有重要意義，但其分子機制尚不明確[4]。研究表明，低氧環境會導致ADAM8過表達，并與骨肉瘤、結腸癌、胃癌和胰腺癌中腫瘤細胞的惡性增殖、轉移和不良預后相關[8]。低氧環境會刺激Panc-1細胞，使ADAM8的前體和活性形式都顯著上調。使用丙泊酚可以很好地抑制ADAM8在胰腺癌細胞中的表達，在低氧條件下，丙泊酚對胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力均具有抑制作用。本研究結果顯示，低氧條件下，丙泊酚可以抑制胰腺癌Panc-1細胞中ADAM8蛋白表達，并抑制細胞的增殖及侵襲能力。

大多數實體瘤中氧供應和需求之間的不平衡導致低氧微環境，這對促進人類惡性腫瘤的發展具有至關重要的作用[9]。越來越多的證據揭示了缺氧對胰腺癌的作用。Cao等[10]報道了缺氧通過誘導旁分泌骨橋蛋白/整合素αvβ3的表達來促進胰腺癌細胞上皮-間充質轉化，并通過調節叉頭框蛋白M1（forkhead box M1，FOXM1）表達促進腫瘤干細胞產生。Deng等[11]研究表明，低氧誘導的長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）-BX111通過調節E盒結合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）的轉錄促進胰腺癌轉移和進展。Li等[12]研究揭示了lncRNA-NORAD能夠增強低氧誘導的上皮-間充質轉化，從而促進胰腺癌的轉移。Lu等[13]研究提出miRNA-142通過靶向腫瘤微環境中的缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）調節胰腺癌細胞的增殖和侵襲。Chen等[14]闡明低氧不僅能夠誘導TWIST蛋白激活上皮-間充質轉化，還能在體外和裸鼠中促進胰腺癌細胞增殖。本研究發現，丙泊酚能夠在低氧環境下抑制ADAM8的表達。

綜上所述，丙泊酚可能通過抑制ADAM8的表達拮抗低氧環境，從而抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲。