HPLC法測(cè)定海南產(chǎn)白胡椒中胡椒堿的含量

馮真英,李嘉敏,吳春玲,葉少玲,陳文興,劉芳芳

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,廣東 湛江 524001;2.嶺南師范學(xué)院,廣東 湛江 524048)

市場(chǎng)上買賣的胡椒主要有黑胡椒和白胡椒,未成熟的胡椒果實(shí)經(jīng)過(guò)水煮、干燥、發(fā)酵、烘干后,果皮酶變后呈黑色,稱為黑胡椒;把胡椒成熟的果實(shí)在水中浸泡一個(gè)星期后,除種子外果皮、果肉等全部腐爛后脫落,洗凈后僅剩下種子,將種子干燥后可得到白胡椒[1]。白胡椒中含有多種生物堿,主要包括:胡椒堿A、胡椒油堿B及C、胡椒林堿、胡椒新堿等[2]。胡椒堿在白胡椒所含生物堿中占比最大,是胡椒的主要活性成分,胡椒的辛辣味也大部分源于胡椒堿[3],白胡椒果實(shí)中胡椒堿含量最高,根次之,再到莖,葉中沒有胡椒堿[4]。胡椒堿的分子式為C17H19NO3,相對(duì)分子質(zhì)量為285.33[5],其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 胡椒堿結(jié)構(gòu)式

白胡椒可以用于治療多種疾病,胡椒堿是白胡椒的主要有效成分,目前已知胡椒堿有抗氧化活性、抗腫瘤活性、抗抑郁活性,并且具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)藥物代謝、減少炎癥的發(fā)生[6]及抗增殖[7]等作用。白胡椒中胡椒堿定量分析測(cè)定的主要方法有比色法、薄層紫外掃描法、紫外分光光度法[8-10],薄層紫外掃描法受到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的儀器的限制,比色法操作相對(duì)復(fù)雜,而紫外分光光度法操作簡(jiǎn)潔、快速,但是不夠精準(zhǔn),《中華人民共和國(guó)藥典》2020版規(guī)定可采用高效液相色譜法的方法測(cè)定胡椒堿中的含量,現(xiàn)在HPLC法越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于藥物分析中,在中藥定量分析檢測(cè)中具有簡(jiǎn)便、快速、高效、靈敏等優(yōu)點(diǎn),可為胡椒中胡椒堿含量測(cè)定提供有效的分析方法,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)中所需儀器型號(hào)及廠家見表1。

表1 主要儀器

1.2 試劑和藥物

實(shí)驗(yàn)中所需試劑和藥品見表2。

表2 主要試劑和藥物

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液

用分析天平稱取5.45mg胡椒堿對(duì)照品,置于棕褐色量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇溶解稀釋,定容至25mL,搖勻即得對(duì)照品母液。用1 mL移液管精密量取對(duì)照品母液1 mL,置于10 mL棕褐色量瓶中,用無(wú)水乙醇定容,搖勻,即得濃度為21.8 μg/ mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

取過(guò)60目篩的胡椒粉0.25 g 置于25 mL棕色容量瓶,加入4 mL 85%乙醇,輕微晃動(dòng)置乙醇全部潤(rùn)濕胡椒粉,置于升溫至85℃水浴鍋中加熱回流1 h,提取1次,抽濾旋干定容于25 mL棕色容量瓶中,用濃度為100%的乙醇溶解稀釋,定容至刻度線處,搖勻,用1 mL移液管從25 mL棕色容量瓶中移取1 mL溶液加入到10 mL棕色容量瓶中,搖勻后,過(guò)0.45 μm微孔濾膜,即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為KromasilC18色譜柱(4.6 mm × 250 mm× 5 μm);流動(dòng)相是甲醇∶水(74∶26);流速是1 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)是343 nm;柱溫箱溫度為30℃;進(jìn)樣體積是20 μL。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液20 μL及供試品溶液20 μL,按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果胡椒堿的理論板數(shù)大于5000,與相鄰雜峰的分離度大于2.0,峰寬比較窄且為單一成分峰(見圖2),保留時(shí)間在10 min以內(nèi),適合快速分析。

圖2 HPLC色譜圖A-對(duì)照品溶液,B-供試品溶液,1-胡椒堿

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取胡椒堿對(duì)照品溶液0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 mL至容量為10 mL的棕色量瓶中,用無(wú)水乙醇稀釋、定容并搖勻。吸取6份不同濃度的溶液各20 μL注入HPLC中,每一濃度測(cè)定三次。按照以上色譜條件測(cè)定峰面積,以峰面積作為Y軸(縱坐標(biāo)),對(duì)照品濃度作為X軸(橫坐標(biāo)),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算相關(guān)系數(shù)和回歸方程。由表3可知,胡椒堿在13.08 ～78.48 μg/mL的濃范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程為Y=156362X-67957。結(jié)果表明其相關(guān)程度高,能夠反映峰面積與濃度的關(guān)系(見表3)。

表3 胡椒堿對(duì)照品溶液濃度與峰面積

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取制作標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度為78.48 μg/mL對(duì)照品溶液20 μL,在相同的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次,分別測(cè)定其峰面積,計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.22%,小于0.3%,說(shuō)明儀器的精密性良好(見表4)。

表4 精密度試驗(yàn)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按供試品溶液制備的方法,共平行制備5份,進(jìn)樣20 μL,依法測(cè)定峰面積值,結(jié)果RSD=3.35%,表明此法重現(xiàn)性較好(見表5)。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一供試品溶液,分別于0、2、4、6、8小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果RSD=4.95%。小于5%,說(shuō)明該樣品的穩(wěn)定性良好(見表6)。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取5個(gè)10 mL棕色容量瓶,精確移取己知含量的重復(fù)性試驗(yàn)第5份供試品溶液1 mL,然后從濃度為78.48 μg/mL對(duì)照品溶液中移取2.7 mL、2.7 mL溶液,分別置于第一、二號(hào)瓶中,從濃度為65.4 μg/mL對(duì)照品溶液中移取3.0 mL、2.55 mL溶液,分別置于第三、四號(hào)瓶中,從濃度為52.32 μg/mL對(duì)照品溶液中移取3.1 mL、3.2 mL溶液,分別置于第五、六號(hào)瓶中,按供試品制備測(cè)定加樣回收率,結(jié)果顯示用胡椒堿做外標(biāo)測(cè)量胡椒堿含量時(shí),RSD為2.46%,說(shuō)明胡椒堿穩(wěn)定,胡椒堿少與其他物質(zhì)反應(yīng)(見表7)。

表7 胡椒中胡椒堿加樣回收率

2.9 樣品含量測(cè)定

取白胡椒約1 g,精密稱定,按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄胡椒堿的峰面積并按以下公式計(jì)算其含量:胡椒堿含量=(峰面積+67957)×稀釋倍數(shù)÷(156372×106×稱量質(zhì)量)×100%,最后得出白胡椒中胡椒堿的含量為3.4%。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

胡椒堿具有十分豐富的藥理活性,本文選用胡椒堿含量為指標(biāo),測(cè)定白胡椒中的含量,有利于科學(xué)評(píng)價(jià)白胡椒的藥用價(jià)值及質(zhì)量,為白胡椒的進(jìn)一步研究分析提供技術(shù)支撐。本文采用的色譜條件,分離效果好,方法簡(jiǎn)捷可靠,可用于胡椒堿的含量測(cè)定及控制白胡椒的質(zhì)量。穩(wěn)定性試驗(yàn)中RSD為4.95%,數(shù)值較大,說(shuō)明胡椒堿的穩(wěn)定性較差,要現(xiàn)提現(xiàn)測(cè),縮短提取及檢測(cè)時(shí)間,提高試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

3.2 流動(dòng)相條件選擇

分析比較實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可知,流動(dòng)相比例為甲醇∶超純水=66∶34時(shí),保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng);綜合比較其余三組,最終確定色譜條件如下:KromasilC18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動(dòng)相∶甲醇-水(74∶26);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)343 nm,柱溫:30℃;在上述色譜條件下,胡椒堿的保留時(shí)間為8.87 min,適合快速分析。

3.3 提取工藝的選擇

白胡椒中提取胡椒堿試驗(yàn)影響最顯著的幾個(gè)因素是料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù),確定影響因素后,先后進(jìn)行單因素考察,以胡椒堿提取率為指標(biāo),考察每一因素對(duì)胡椒堿提取率影響大小,通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出,白胡椒醇提胡椒堿實(shí)驗(yàn)中,對(duì)胡椒堿提取率影響最顯著的幾個(gè)因素及影響因素顯著大小順序?yàn)?提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間,后經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)、驗(yàn)證試驗(yàn)得出白胡椒中提取胡椒堿的最優(yōu)提取工藝為提取溫度85℃、料液比1∶16、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取時(shí)間1 h。

3.4 建立含量測(cè)定的意義

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,胡椒堿具備抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎、降糖、抗抑郁等廣泛的生物活性[11]。本試驗(yàn)建立了白胡椒中胡椒堿的高效液相色譜的含量測(cè)定方法,以此進(jìn)一步科學(xué)、系統(tǒng)開發(fā)白胡椒中胡椒堿的成分的提取純化,為其合理利用和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)利用外標(biāo)的HPLC測(cè)定海南產(chǎn)白胡椒中胡椒堿的含量,經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性等方法學(xué)考察,證實(shí)該方法是可行的,在該條件下所測(cè)得的白胡椒中胡椒堿的含量為3.2%。