天津地區(qū)RhD陰性圍產(chǎn)期婦女RHD基因分型及Rh表型分析

韓雪，韓紅梅，李捷

天津市第五中心醫(yī)院輸血科，天津 300450

Rh 血型系統(tǒng)在人類紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最具高度多態(tài)性，抗原復(fù)雜多變。在Rh 血型系統(tǒng)最重要的D、E、C、c、e5種抗原中，D 抗原免疫原性最強(qiáng)，由RHD基因編碼，10 個(gè)外顯子組成，編碼區(qū)總長為1 251 bp，編碼417個(gè)氨基酸組成的糖蛋白。D抗原存在多種變異體，包括部分D 型(partial D)、弱D (week D)型、DEL等，是臨床上引起新生兒溶血病、溶血性輸血反應(yīng)的最主要的血型抗原，對(duì)D抗原陰性孕婦的妊娠結(jié)局具有重要的臨床意義。關(guān)于Rh陰性個(gè)體的血清學(xué)表型、RHD基因型檢測分析一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，不同地區(qū)民族皆對(duì)其有相關(guān)報(bào)道。本文旨在對(duì)天津地區(qū)RhD陰性的孕產(chǎn)婦RHD基因分型進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源 收集2017 年1 月至2019 年12月在天津市第五中醫(yī)醫(yī)院產(chǎn)科就診的圍產(chǎn)期婦女標(biāo)本10 139例，其中RhD抗原血清學(xué)初篩試驗(yàn)陰性標(biāo)本104 例，年齡20～39 歲，平均(28.72±7.65)歲，每例留取EDTA抗凝血標(biāo)本約5 mL。納入標(biāo)準(zhǔn)：①產(chǎn)前RhD檢測結(jié)果為陰性；②彩超檢查均為單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①異位妊娠者；②孕期合并有子宮內(nèi)膜炎、既往有血液、免疫系統(tǒng)疾病史的患者和臨床資料不完整者。本研究經(jīng)天津市第五中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 試劑 ABO、RhD 血型定型檢測卡(單克隆抗體) (生產(chǎn)批號(hào)20151204、20161204、20171204、20181204，長春博訊生物技術(shù)有限公司)；RhD血型抗原檢測卡(單克隆抗體)(生產(chǎn)批號(hào)20160601、20170601、20180601，長春博訊生物技術(shù)有限公司)；核酸提取或純化試劑盒(天津秀鵬，生產(chǎn)批號(hào)201808001)；人類紅細(xì)胞RHD 基因分型試劑盒(PCR-SSP 法)(天津秀鵬，生產(chǎn)批號(hào)201810002)；瓊脂糖(Biowest)；EB 染料(天津秀鵬，生產(chǎn)批號(hào)201703001)。

1.3 儀器 TD-3A型血型血清學(xué)離心機(jī)(長春博訊科研儀器有限責(zé)任公司)；渦旋混勻器(其林貝爾VDRTEX-5)；高速離心機(jī)(SIGMA SIGMA1-14)；水浴鍋(天津泰斯特HHW21.420AⅡ)；PCR 擴(kuò)增儀(ABI 9700型)；凝膠成像系統(tǒng)(Clinx GenoSens1860)。

1.4 方法

1.4.1 Rh抗原檢測 采用Rh血型抗原試劑卡檢測D、C、c、E、e 5種抗原，Rh血型抗原檢測卡每孔加入1%待檢紅細(xì)胞懸液50 μL，離心后，根據(jù)待檢紅細(xì)胞與檢測卡RhC、c、D、E、e 單克隆抗體反應(yīng)格局，判讀Rh血型表型結(jié)果。

1.4.2 基因組DNA的提取 嚴(yán)格按照天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑盒說明書操作，提取104 例經(jīng)抗人球蛋白法確定為RhD陰性的樣本提取基因組DNA備用。DNA產(chǎn)物應(yīng)該保存在-20℃，以防DNA降解。

1.4.3 PCR檢測 根據(jù)《人類紅細(xì)胞RhD基因分型試劑盒(PCR-SSP 法)》說明書，在ABI9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行試驗(yàn)操作，操作步驟如下：將80 μL dNTP-Buffer工作液、0.8 μL Taq 酶和10 μL DNA 總共90.8 μL 混合液漩渦混勻并瞬時(shí)離心；向每個(gè)引物孔(1～8孔)各加入10 μL 上述混合液。PCR 循環(huán)參數(shù)為96℃2 min，1 個(gè)循環(huán)；96℃20 s，68℃60 s，5 個(gè)循環(huán)；96℃20 s，65℃50 s，72℃45 s，10 個(gè)循環(huán)；96℃20 s，62℃50 s，72℃45 s，18 個(gè)循環(huán)；72℃5 min，1 個(gè)循環(huán)。將PCR 產(chǎn)物移至2.5%瓊脂糖凝膠電泳孔中，電泳參數(shù)設(shè)置為140～150 V電泳15～20 min，電泳后紫外光下成像儀拍照記錄并對(duì)照說明書判讀結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Rh 血型系統(tǒng)抗原檢測 104 份陰性標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)CCEe、CcEE 及CCEE表型，其他抗原表型由多至 少 分 別 為ccee 57 例(54.8%)、Ccee 29 例(27.9%)、ccEe 10 例(9.6%)、CCee 4 例(3.8%)、ccEE 3 例(2.9%)、CcEe 1例(1%)。

2.2 RhD 陰性圍產(chǎn)期婦女標(biāo)本RHD 基因分型 104 例RhD 陰性圍產(chǎn)期婦女中RHD 基因全缺失型70 例，占全部陰性標(biāo)本的67.3%；DEL RHD 1227A純合型標(biāo)本13例，占全部陰性標(biāo)本的12.5%；RHD-CE(2-9)-D標(biāo)本10例，占全部陰性標(biāo)本的9.6%；弱D15型標(biāo)本5 例，占全部陰性標(biāo)本的4.8%；DEL RHD 1227A雜合型標(biāo)本2 例，占全部陰性標(biāo)本的1.9%；RhD 陽性標(biāo)本2 例，占全部標(biāo)本的1.9%；另外有2 例不能用此PCR-SSP 試劑盒確定其基因型，占全部標(biāo)本的1.9%。見圖1。不規(guī)則抗體篩查檢出3 例陽性，其抗體為抗-D，基因分型均為全缺失型。

圖1 RHD基因分型PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳的條帶格局

2.3 RHD 基因型及Rh 表型 70 例RHD 完全缺失型中ccee 55例(78.6%)、Ccee 11例(15.7%)、ccEe 4例(5.7%)，其他RHD基因分型及Rh表型分布見表1。

表1 RHD基因分型及Rh表型分布[例(%)]

3 討論

Rh血型系統(tǒng)具有復(fù)雜多態(tài)性，在臨床輸血體系中占有重要地位，僅次于ABO血型系統(tǒng)。本研究104例RhD陰性標(biāo)本的Rh表型ccee(54.8%)和Ccee(27.9%)頻率最高。基因分型中RHD全缺失型為大多數(shù)，占全部標(biāo)本的67.3%，其Rh 表型主要是ccee (78.6%)，說明RHD全缺失型與ccee表型具有高度關(guān)聯(lián)性。

D 抗原具有多種變異體，不同民族和地區(qū)的分子背景均有不同，有研究表明RHD基因之間產(chǎn)生的氨基酸重排和基因突變影響了抗原的表達(dá)[1]。目前發(fā)現(xiàn)亞洲人群中存在部分D(partial D)、弱D(weak D)、Del 等變異體[2]。部分D 主要有RHD-CE(2-9)-D、DVIⅢ、RHD-CE(2-7)-D2 等類型，由于RHD 基因與RHCE 基因在方向上相反，有很大的概率產(chǎn)生替換，表現(xiàn)為缺失一個(gè)或多個(gè)抗原表位，且易被致敏產(chǎn)生對(duì)應(yīng)缺失的抗原表位的抗體。RHD-CE(2-9)-D 型是中國人群中主要的等位基因，其分子機(jī)制是缺少2～9 外顯子，本研究中共檢出10 例，分別在表型Ccee (60%)、ccEe(40%)中檢出，與先前國內(nèi)學(xué)者檢測RHD-CE(2-9)-D等位基因存在于CDe 單體型中的結(jié)果[3]不一致，表明RHD-CE(2-9)-D 等位基因與RhC/E 抗原之間沒有明確聯(lián)系。

BECKER 等[4]采用Southern 分析技術(shù)及PCR基因定型分析了弱D中RHD基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)弱D的基因組及轉(zhuǎn)錄水平與正常D表型相比，均未顯示任何差異。弱D的弱免疫原性不能用RHD基因本身的結(jié)構(gòu)差異來解釋，D抗原的弱表達(dá)可能是Rh相關(guān)復(fù)合物中的相關(guān)因素或尚未確定的抑制基因引起的。另有研究認(rèn)為，弱D由于發(fā)生了氨基酸替換和外顯子突變[5]。突變處于跨膜區(qū)，可能影響紅細(xì)胞膜的表達(dá),導(dǎo)致紅細(xì)胞膜上的抗原數(shù)量減少，而抗原表位不變。國外已有報(bào)道弱D型供血者的紅細(xì)胞輸注給Rh陰性患者，刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG 抗體并引起嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)[6]。其中弱D 最常見有弱D15 型和弱D12 型，而弱D15 型在中國人群中被廣泛發(fā)現(xiàn)，同樣可激發(fā)同種免疫反應(yīng)，所以應(yīng)重視對(duì)弱D15型的檢測。本次實(shí)驗(yàn)共檢測出5例弱D15型，血清分型分別是Ccee(60%)和CcEe(40%)。

Del 型極弱表達(dá)D 抗原，只有通過吸收放散的方法才能檢測到，輸注給Rh 陰性患者仍會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。各地Del表型的分子機(jī)理各有其特點(diǎn)，中國漢族人群的研究資料表明，Del型主要由RHD1227A等位基因編碼組成[7]。亞洲RhD陰性個(gè)體中，Del型占較高比例，高加索人RhD陰性個(gè)體中Del 型占0.33%[8]，國內(nèi)報(bào)道為15.6%～29.95%[9-11]。本研究檢出Del RHD1227A 型15 例，占14.4%，略低于國內(nèi)平均水平，說明Del 型的分布存在一定的地區(qū)差異。其血清表型分別為Ccee、CCee 及CcEe，推測1227A 可能與C抗原相關(guān)，但由于本次研究標(biāo)本量較少，這一觀點(diǎn)還需要大量標(biāo)本進(jìn)一步研究證實(shí)。雖然DEL 型具有完整的RHD 基因，但極弱的表達(dá)D抗原，臨床上將它歸為RhD陰性。有研究發(fā)現(xiàn)DEL型與正常D抗原相比，具有很少的抗原分子數(shù)量，每個(gè)紅細(xì)胞上的D抗原分子數(shù)量可能在30個(gè)以下[12]。1227A因其位于第9外顯子最后一位，影響了mRNA 的正常連接形成了短的mRNA，從而降低了RHD基因的表達(dá)效率，也就造成了紅細(xì)胞膜上的D抗原分子數(shù)量明顯減少。邵超鵬等[13]研究說明，編碼RhD 1227A 等位基因的中國漢族Del 個(gè)體100%攜帶RHD 基因。如果Del 型個(gè)體表達(dá)完整的D 抗原，Del個(gè)體將可能不會(huì)被D 抗原致敏產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本文中104 例標(biāo)本中有3 例產(chǎn)生了抗-D，其基因型均為全缺失型，可以印證上述觀點(diǎn)。也就是說Del 患者可以輸注RhD陽性紅細(xì)胞而不產(chǎn)生抗-D抗體，Del型女性妊娠RhD 陽性胎兒將可能不會(huì)引起新生兒溶血病。對(duì)于這部分孕婦，在整個(gè)孕期及產(chǎn)后不需要注射RhD免疫球蛋白，可免去產(chǎn)婦注射免疫球蛋白產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，以及對(duì)是否發(fā)生新生兒溶血病的心理壓力。目前，國際上均不對(duì)Del 型進(jìn)行檢測，將其作為RhD陰性血型對(duì)待，供給RhD陰性患者使用。而由于輸注Del血液而產(chǎn)生抗-D的病例并不罕見，這無疑存在很多弊端和風(fēng)險(xiǎn)。國外已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RhD 陰性孕產(chǎn)婦被Del型胎兒紅細(xì)胞免疫和RhD陰性受血者輸注Del型血液，而產(chǎn)生抗-D抗體的病例[14-16]。由此可見，結(jié)合血清學(xué)檢查和RHD基因分型對(duì)RhD陰性產(chǎn)婦和臨床輸血均具有重要的意義。

通過本次研究，基本確定了RhD陰性產(chǎn)婦的基因分型情況，但仍有部分個(gè)體的基因型通過此PCR-SSP法無法確定，需對(duì)其外顯子測序才能明確其基因型。本文也證實(shí)了RhD 陰性個(gè)體的D 基因多態(tài)性，研究RHD基因的變異，對(duì)人類輸血安全和預(yù)防新生兒溶血病的發(fā)生具有重要意義。