miR?375靶向YAP1調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制研究

何小麗 林蓓蓓 范幸

宮頸癌是一種常見(jiàn)的發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，給女性的生命健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅［1］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度為19～25 個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，被認(rèn)為是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控因子［2］。研究顯示，miRNAs 參與調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，已成為腫瘤生物靶向治療的靶標(biāo)［3］。YAP1 是Hippo 信號(hào)通路的組成部分，通路包含像Hippo/MST1?2 激酶、Sav1 結(jié)合體、LATS1/2 激酶在內(nèi)的激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。裴峰等［4］研究表明，LATS1/2 激酶對(duì)腫瘤有抑制作用，而YAP1 有致瘤基因的功能，調(diào)控YAP1 表達(dá)可能成為宮頸癌靶向治療的新思路。miR?375 在宮頸癌等實(shí)體瘤內(nèi)為異常低表達(dá)，提示其有可能存在抑癌基因的效應(yīng)，但目前miR?375 是否通過(guò)靶向YAP1 調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為尚未明確［5］。本文通過(guò)探討miR?375 靶向YAP1 調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制，旨在為臨床診斷及靶向治療宮頸癌的提供新的方向。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年1月在長(zhǎng)沙市婦幼保健院行宮頸癌根治術(shù)患者50 例，取切除的癌組織、癌旁組織標(biāo)本。患者平均年齡（58.27±9.57）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《宮頸癌診斷與治療指南（第四版）》中宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，且經(jīng)病理確診為原發(fā)性宮頸癌；②未并發(fā)其他腫瘤；③無(wú)惡性腫瘤家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理資料及隨訪信息不完整者，臨床病理資料包含組織學(xué)分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期（Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）等。本研究已獲得長(zhǎng)沙市婦幼保健院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且均經(jīng)患者知情同意。

1.2 方法

取標(biāo)本磨碎后勻漿，12 000 rpm 轉(zhuǎn)速離心15 min（離心半徑10 cm）。TRIzol 試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司）提取總RNA。mRNA 和mi?croRNA 的反轉(zhuǎn)錄分別使用PrimeScriptTMRT Mas?ter Mix（TaKaRa，日本）和miScript Reverse Tran?scription Kit（Qiagen，德國(guó)）。使用Mastercycler nexus X2（Eppendorf，德國(guó)）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real?time fluorescence quantitative polymerase chain reaction technology，qRT?PCR）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃，15 s，60℃，60 s，72℃，40 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。用2?ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)，并分別以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算miR?375和YAP1mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌細(xì)胞系Hela 購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。將細(xì)胞放在含有10%胎牛血清（Sigma?Aldrich，St.Louis，美國(guó)）、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素的RPMI 1640（Gibco，Rock?ville，美國(guó)）培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）中靜置培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組

細(xì)胞按照3×105接種細(xì)胞，待細(xì)胞融合度80%時(shí)，去病毒上清按照最優(yōu)的感染復(fù)數(shù)MOI 值，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光顯微觀察熒光蛋白。傳代后，換用含抗性DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆。獲得miR?miR?375 細(xì)胞、shYAP1 細(xì)胞、miR?375+YAP1 細(xì)胞。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（normal control，NC）組，予以常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移活性

消化細(xì)胞、重懸后，將上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均勻接種于6 孔板內(nèi)，次日待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿后用微量加樣器槍頭垂直于6 孔板底和標(biāo)記，分別于劃痕后0、12、24、48 h 拍照，用photoshop 軟件測(cè)量劃痕寬度，劃痕愈合率代表遷移能力線劃一條劃痕。

同時(shí)，要結(jié)合實(shí)際，不斷加強(qiáng)現(xiàn)代信息技術(shù)攻關(guān)，針對(duì)農(nóng)業(yè)基層統(tǒng)計(jì)工作實(shí)際情況，探索更加有效的統(tǒng)計(jì)調(diào)查方法，與經(jīng)濟(jì)普查、人口普查等活動(dòng)有機(jī)結(jié)合起來(lái)，不斷構(gòu)建基層農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)信息服務(wù)體系和平臺(tái)，加強(qiáng)部門(mén)聯(lián)動(dòng)[3]，切實(shí)減輕工作人員負(fù)擔(dān)，提高智能化、自動(dòng)化信息檢索和收集統(tǒng)計(jì)效率，提高信息共享利用水平。

1.2.5 細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)技術(shù)（Transwell）檢測(cè)細(xì)胞侵襲活性

基質(zhì)膠溶液均勻鋪在小室，向24 孔板孔內(nèi)加入500 μL 含10% FBS 的培養(yǎng)液，F(xiàn)BS 作為趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞穿膜。將各組細(xì)胞消化、收集、離心、重懸，制成單細(xì)胞懸液后調(diào)整細(xì)胞密度并接種至小室內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)36 h。4%的多聚甲醛溶液中固定10 min，結(jié)晶紫溶液染色5 min，隨機(jī)選取10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)平均每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)各組上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial?Mesenchymal Transiton，EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)情況

檢測(cè)EMT 相關(guān)β?catenin、Snail、Twist、E?cad?herin、Vimentin 的表達(dá)情況。各組細(xì)胞用PBS 清洗3 次后，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，100℃變性5 min，等量蛋白進(jìn)行SDS?PAGE 凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。經(jīng)5%的BSA 封閉1 h 后加入相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜孵育后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h，加入發(fā)光液后凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 熒光素酶系統(tǒng)驗(yàn)證miR?375與YAP1 的靶向性

構(gòu)建YAP1 的3′UTR 區(qū)域突變，將其與mimic和mimic control 共轉(zhuǎn)染入HCT116 細(xì)胞中培養(yǎng)24 h。吸去上清，加入75 μL/孔的新鮮培養(yǎng)基，并加入75 μL/孔配置好的Luciferase 底物，震蕩10 min，用多光能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值；加入75 μL/孔配置好的Stop regent，震蕩10 min，測(cè)定熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（）表示，行t檢驗(yàn)；Pearson 分析miR?375 與YAP1 表達(dá)的相關(guān)性，另分析miR?375 與YAP1 表達(dá)與宮頸癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?375、YAP1 表達(dá)量比較

與癌旁組織相比，miR?375 在癌組織當(dāng)中低表達(dá)，YAP1 在癌組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 miR?375、YAP1 表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of miR?375 and YAP1 expression levels（±s）

表2 miR?375、YAP1 表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of miR?375 and YAP1 expression levels（±s）

分組癌組織癌旁組織t 值P 值n 50 50 miR?375 0.58±0.11 3.58±0.87 24.190<0.001 YAP1 4.76±0.68 0.47±0.09 44.225<0.001

圖1 miR?375、YAP1 在宮頸癌及癌旁組織的表達(dá)量比較Figure 1 Comparison of Mir?375 and YAP1 expression levels in cervical cancer tissues and adjacent tissues

2.2 miR?375 和YAP1 mRNA 與宮頸癌組織的相關(guān)性

Pearson 分析顯示miR?375 和YAP1 mRNA 在宮頸癌組織中呈負(fù)相關(guān)（r=-0.973，P<0.001）。

2.3 miR?375 和YAP1 mRNA 表達(dá)與宮頸癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

miR?375 和YAP1mRNA 在不同組織學(xué)分級(jí)、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 miR?375 和YAP1 mRNA 表達(dá)與宮頸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系（±s）Table 3 Relationship between miR?375 and YAP1 mRNA expression and clinicopathological features of cervical cancer（±s）

表3 miR?375 和YAP1 mRNA 表達(dá)與宮頸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系（±s）Table 3 Relationship between miR?375 and YAP1 mRNA expression and clinicopathological features of cervical cancer（±s）

臨床病理特征年齡（歲）n t 值1.745 P 值0.087 t 值0.125 P 值0.901組織學(xué)分級(jí)49.451<0.001 10.188<0.001 FIGO 分期33.920<0.001 15.999<0.001肌層浸潤(rùn)深度分類≥60<60 G1+G2 G3Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期≥1/2<1/2 1.734 0.089 0.487 0.628淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31.167<0.001 14.376<0.001病理學(xué)類型是否鱗癌1.095 0.279 0.235 0.815腺癌21 29 18 32 30 20 18 32 30 20 45 5 miR?375 0.35±0.02 0.36±0.02 0.54±0.03 0.19±0.02 0.55±0.05 0.15±0.02 0.36±0.03 0.35±0.01 0.21±0.02 0.43±0.03 0.36±0.02 0.35±0.01 YAP1 3.63±0.29 3.62±0.27 3.24±0.21 4.12±0.33 3.04±0.23 4.35±0.35 3.61±0.21 3.65±0.31 4.23±0.24 3.11±0.31 3.64±0.27 3.61±0.28

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移活性

24 h、48 h 時(shí)miR?375mimic、shYAP1 細(xì)胞遷移率低于NC 和sh?miR?375+sh?YAP1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hela 細(xì)胞的遷移活性Figure 2 Cell scratch assay for migration activity of Hela cells

2.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲活性

24 h miR?375 mimic、shYAP1 細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯低于NC 和sh?miR?375+sh?YAP1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；miR?375 mimic、shYAP1 細(xì)胞侵襲數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），NC 和sh?miR?375+sh?YAP1 細(xì)胞侵襲數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 Transwell 檢測(cè)Hela 細(xì)胞的侵襲Figure 3 Invasion of Hela cells detected by Transwell

2.6 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)情況

miR?375 mimic、shYAP1 細(xì)胞β?catenin、Snail、Twist、E?cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)明顯明顯低于NC 和sh?miR?375+sh?YAP1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot 法檢測(cè)Hela 細(xì)胞β?catenin、Snail、Twist、E?cadherin、Vimentin 表達(dá)Figure 4 Expression of β?catenin，Snail，Twist，e?cadherin and Vimentin in Hela cells detected by Western blot

2.7 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)研究miR?375 與YAP1靶向關(guān)系

miR?29a 降低含有WT 3′UTR 的YAP1 的熒光素酶活性，但不降低含有Mut 3′UTR 的YAP1 的熒光素酶活性。見(jiàn)圖5。

圖5 雙熒光酶素試驗(yàn)結(jié)果Figure 5 Results of double luciferase test

3 討論

本研究結(jié)果提示miR?375 在宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。進(jìn)一步結(jié)果表明miR?375 在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平均呈現(xiàn)為異常低表達(dá)，與既往研究［7］一致。miR?375在宮頸癌中存在異常低表達(dá)已得到多項(xiàng)研究證實(shí)，Bayra?moglu 等［8］發(fā)現(xiàn)其在宮頸鱗癌中低表達(dá)，且可通過(guò)靶向轉(zhuǎn)錄因子SP1 抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程；Morel 等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR?375通過(guò)抑制蛋白E6 蛋白從而抑制人宮頸癌HPV16 細(xì)胞增殖、侵襲過(guò)程。為了進(jìn)一步明確miR?375在宮頸癌細(xì)胞侵襲、遷移中的作用，通過(guò)轉(zhuǎn)化的平板中挑去陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證后，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示24 h、48 h 時(shí)miR?375mimic、shYAP1 細(xì)胞遷移率低于NC 組和sh?miR?375+sh?YAP1；Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR?375 mimic、shYAP1 細(xì)胞侵襲數(shù)量低于NC 和sh?miR?375+sh?YAP1。過(guò)表達(dá)miR?375 可有效抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移，其機(jī)制與靶向YAP1 有關(guān)，提示miR?375 可通過(guò)靶向YAP1 抑制宮頸癌的發(fā)展。張強(qiáng)等［10］研究顯示，miR?375 具有阻滯宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控PIK3CA 密切相關(guān)，提示miR?375 可能在宮頸癌中發(fā)揮抑癌作用。

miRNA 調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能主要是通過(guò)與靶基因3′UTR 結(jié)合，因此，本研究通過(guò)生物信息學(xué)平臺(tái)RNAInter 進(jìn)行預(yù)測(cè)，確定YAP1 評(píng)分較高的靶點(diǎn)（Confidence Score=0.982）。YAP1 是Hippo通路中重要的組成部分，已被證實(shí)是一個(gè)促腫瘤靶點(diǎn)［11］。YAP1 基因的mRNA 在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)均呈現(xiàn)高表達(dá)，且和腫瘤的進(jìn)展有較強(qiáng)的相關(guān)性。此外，周雅青等［12］研究表明，YAP1 能對(duì)多數(shù)細(xì)胞株起到體外誘導(dǎo)作用引發(fā)EMT，進(jìn)而推動(dòng)惡性腫瘤的發(fā)展。ENT 是腫瘤微環(huán)境調(diào)控癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的最重要機(jī)制，上皮性腫瘤細(xì)胞發(fā)生ENT 表示著細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲能力加強(qiáng)［13］。因此，本研究通過(guò)Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR?375 mimic、shYAP1 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)低于NC 組和sh?miR?375+sh?YAP1 組，提示miR?375 能夠抑制細(xì)胞EMT，而YAP1 能夠促進(jìn)細(xì)胞EMT。葉星明等［14］表示miR?375 可通過(guò)靶向YAP1 的表達(dá)對(duì)曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞株的EMT 進(jìn)行調(diào)控。

本研究的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示，YAP1 是miR?375 靶標(biāo)，且miR?375 與YAP1 3′UTR 區(qū)域存在結(jié)合位點(diǎn)，提示YAP1 可能受到miR?375 的調(diào)節(jié)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)miR?375 與YAP1 在腫瘤組織中呈負(fù)相關(guān)，與Kang 等［15］報(bào)道一致，結(jié)果提示miR?375 參與宮頸癌的發(fā)生，異常低表達(dá)會(huì)促進(jìn)疾病發(fā)生惡化。本研究還探討了miR?375 和YAP1 mRNA 表達(dá)與宮頸癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR?375 和YAP1 mRNA 表達(dá)在不同組織學(xué)分級(jí)、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示miR?375、YAP1 在宮頸癌的發(fā)展及淋巴轉(zhuǎn)移過(guò)程有參與作用，同時(shí)也表明了miR?375、YAP1 可作為宮頸癌術(shù)后監(jiān)測(cè)及預(yù)后的臨床參考指標(biāo)。

綜上所述，可通過(guò)miR?375 靶向負(fù)調(diào)控YAP1從而抑制EMT，進(jìn)一步抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲以及遷移，為宮頸癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。此外，術(shù)后的miR?375、YAP1 的表達(dá)情況可作為臨床上術(shù)后的監(jiān)測(cè)及預(yù)后指標(biāo)。