血清miR?126、IGF?1水平與糖尿病前期人群結(jié)腸息肉發(fā)病的相關(guān)性

張慧慧 葉美霞 鄧金鳳 李鑫楠 陳赟 鐘印芹★

結(jié)腸息肉是指從結(jié)腸粘膜表面突出到腸腔的息肉狀病變，在未確定病理性質(zhì)前均稱為結(jié)腸息肉，通常分為非腺瘤性息肉和腺瘤性息肉［1］。糖尿病（diabetes mellitus，DM）前期人群血糖值較正常人高，但尚不符合確診DM 的標(biāo)準(zhǔn)，此類人群不僅容易逐漸發(fā)展為2 型糖尿病，而且患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高［2］。目前認(rèn)為大多數(shù)結(jié)腸癌患者是由結(jié)腸息肉演變而來，因此探討DM 前期人群中結(jié)腸息肉發(fā)病的相關(guān)指標(biāo)，早期發(fā)現(xiàn)并切除結(jié)腸息肉，對(duì)防治DM 前期患者結(jié)腸癌變具有積極意義。研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型DM 血管并發(fā)癥患者血清微小RNA?126（miR?126）表達(dá)降低［3］。另有研究顯示胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Insulin?like Growth Factor?1，IGF?1）調(diào)節(jié)的腦激素信號(hào)系統(tǒng)紊亂是DM 發(fā)生的關(guān)鍵因素之一［4］。由于miR?126、IGF?1 與DM 前期人群并發(fā)結(jié)腸息肉的關(guān)系尚不十分明確，因此本研究通過聯(lián)合檢測(cè)血清miR?126 與IGF?1 表達(dá)水平，探討其與DM 前期人群結(jié)腸息肉發(fā)病的關(guān)系，以期為提高對(duì)DM 前期人群結(jié)腸息肉發(fā)病診斷的準(zhǔn)確性、從而防止結(jié)腸息肉癌變提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年11月至2021年3月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科治療的673 例DM 前期患者，根據(jù)《中國癌癥篩查及早診早治指南（試行）》［5］規(guī)定，初篩出185 例結(jié)腸癌高危的DM 前期患者，遵醫(yī)囑完成全結(jié)腸鏡檢查者共169 例，其中88 例結(jié)腸黏膜病變中檢出結(jié)腸息肉患者71 例作為DM 前期息肉組，結(jié)腸黏膜無病變者81 例作為DM 前期無息肉組。同期選取于本院腔鏡中心進(jìn)行全面健康體檢且經(jīng)75 g 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)證實(shí)為糖耐量正常者140 例作為對(duì)照組，其中檢出結(jié)腸息肉29 例作為正常息肉組，無結(jié)腸息肉111 例作為正常無息肉組。DM 前期人群納入標(biāo)準(zhǔn)：①空腹血糖≥6.1 mmol/L 但<7.0 mmol/L 或餐后2 小時(shí)血糖≥7.8 mmol/L 但<11.1 mmol/L；②配合度高，已被告知研究過程并自愿參加本實(shí)驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①高血壓、心臟病、肝腎疾病等慢性病史；②腦部疾病、精神疾病；③吸煙、酗酒等不良生活習(xí)性者。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：KR116）購自北京天根生化有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）（貨號(hào)：RR037A）及Trizol 試劑（貨號(hào)：JMS12279）均購自日本TaKaRa 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real?time PCR，qRT?PCR）儀（型號(hào)：MiniAmp）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Human IGF?1 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）kit（HAKATA，HH?82?1）購自上海傳秋生生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血清樣本的采集

所有受試人員空腹>8 h，均于清晨采集靜脈血3 mL，置于促凝試管中，3 500 r/min 離心15 min，離心半徑為15 cm，吸取血清標(biāo)本置于Eppendrof管中，于-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.3.2 血清miR?126 相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

采用qRT?PCR 測(cè)定血清miR?126 相對(duì)表達(dá)量。從-20℃冰箱中取出血清樣本，Trizol 試劑提取血清總RNA，異丙醇沉淀濃縮后，用75%酒精洗滌，干燥后加入100 μL DEPC 水，檢測(cè)所得RNA 純度及完整度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物置于-20℃保存。qRT?PCR 反應(yīng)（反應(yīng)體系10 μL）：cDNA 模板4 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL。由上海啟因生物科技有限公司設(shè)計(jì)相應(yīng)上下游引物，以U6為內(nèi)參，序列見表1。反應(yīng)條件：95℃變性5 min，循環(huán)1 次；95℃10 s、60℃20 s、72℃20 s，循環(huán)38 次，利用qRT?PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)各樣本平均Ct 值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR?126 相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT?PCR 引物序列Table 1 qRT?PCR primer sequences

1.3.3 血清IGF?1 表達(dá)水平測(cè)定

采用ELISA 法檢測(cè)所有受試者血清中IGF?1 的表達(dá)水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)腸息肉的診斷及分類

由腔鏡中心醫(yī)技人員記錄結(jié)腸鏡下結(jié)腸息肉的檢查結(jié)果，同時(shí)行息肉活檢并將標(biāo)本送病理學(xué)檢查。在測(cè)量息肉直徑時(shí)，若有多個(gè)息肉以直徑最大的息肉作為代表。根據(jù)息肉的臨床特點(diǎn)以及病理結(jié)果，將息肉分為高危息肉［息肉數(shù)量≥3 個(gè)和（或）高度增生不良和（或）絨毛狀結(jié)構(gòu)和（或）息肉直徑≥1 cm］和低危息肉［息肉數(shù)量<3 個(gè)和（或）不伴有高度增生不良和（或）管狀結(jié)構(gòu)和（或）息肉直徑<1 cm］［6］。據(jù)此將DM 前期息肉組分為低危結(jié)腸息肉組和高危結(jié)腸息肉組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以（）表示，兩組間采用t檢驗(yàn)，多組間采用方差F檢驗(yàn)，組間有差異進(jìn)一步采用LSD?t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 法分析DM 前期結(jié)腸息肉患者血清中miR?126、IGF?1表達(dá)水平的相關(guān)性；繪制ROC 曲線分析血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平對(duì)DM 前期結(jié)腸息肉發(fā)病的診斷價(jià)值，曲線下面積比較行Z檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較

四組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、結(jié)腸癌家族史比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），正常無息肉組與正常息肉組空腹血糖比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），DM 前期無息肉組、DM 前期息肉組空腹血糖高于正常無息肉組與正常息肉組，DM 前期息肉組高于DM 前期無息肉組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 一般資料比較［（±s），n（%）］Table 2 Comparison of general data［（±s），n（%）］

表2 一般資料比較［（±s），n（%）］Table 2 Comparison of general data［（±s），n（%）］

注：與正常無息肉組比較，aP<0.05；與正常息肉組比較，bP<0.05；與DM 前期無息肉組比較，cP<0.05。

組別正常無息肉組正常息肉組DM 前期無息肉組DM 前期息肉組χ2/F 值P 值n 111 29 81 71男/女61/50 21/8 43/38 40/31 3.481 0.323年齡(歲)52.66±9.20 51.37±8.35 51.80±8.04 53.59±11.07 0.629 0.597體質(zhì)指數(shù)(kg/m2)22.94±3.51 23.45±3.23 23.86±2.90 24.07±3.48 2.071 0.104空腹血糖(mmol/L)4.86±0.69 4.81±0.72 5.69±0.57ab 5.83±0.48abc 53.357＜0.001結(jié)腸癌家族史25（22.52）9（31.03）20（24.69）19（26.76）1.048 0.790

2.2 四組血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平比較

血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平比較：DM 前期息肉組>DM 前期無息肉組>正常息肉組>正常無息肉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 四組血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum miR?126 and IGF?1 expression levels between the 4 groups（±s）

表3 四組血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum miR?126 and IGF?1 expression levels between the 4 groups（±s）

注：與正常無息肉組比較，aP<0.05；與正常息肉組比較，bP<0.05；與DM 前期無息肉組比較，cP<0.05。

IGF?1（mg/L）161.36±36.93 205.11±44.65a 236.97±56.84ab 247.30±69.28abc 50.296<0.001組別正常無息肉組正常息肉組DM 前期無息肉組DM 前期息肉組F 值P 值n 111 29 81 71 miR?126 17.86±3.68 22.49±6.08a 27.35±6.11ab 40.02±8.53abc 197.183<0.001

2.3 低危、高危結(jié)腸息肉組血清miR?126、IGF?1表達(dá)水平的比較

根據(jù)息肉的臨床特點(diǎn)以及病理結(jié)果，將DM前期息肉組分為低危結(jié)腸息肉組（22 例）和高危結(jié)腸息肉組（49 例）。高危結(jié)腸息肉組患者血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平高于低危結(jié)腸息肉組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 低危、高危結(jié)腸息肉組血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平的比較（±s）Table 4 Comparison of serum miR?126 and IGF?1 expression levels between low?risk and high?risk colon polyp groups（±s）

表4 低危、高危結(jié)腸息肉組血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平的比較（±s）Table 4 Comparison of serum miR?126 and IGF?1 expression levels between low?risk and high?risk colon polyp groups（±s）

組別低危結(jié)腸息肉組高危結(jié)腸息肉組t 值P 值n 22 49 miR?126 32.72±7.00 43.30±9.22 4.791＜0.001 IGF?1（mg/L）218.18±55.95 260.38±75.27 2.351 0.022

2.4 DM 前期結(jié)腸息肉患者血清中miR?126、IGF?1表達(dá)的相關(guān)性

Pearson 結(jié)果顯示，DM 前期結(jié)腸息肉患者血清中miR?126 與IGF?1 表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.447，P<0.05）。

2.5 血清miR?126、IGF?1 表達(dá)對(duì)DM 前期結(jié)腸息肉的診斷價(jià)值

ROC 曲線顯示，血清miR?126 聯(lián)合IGF?1 診斷DM 前期結(jié)腸息肉的曲線下面積明顯高于兩者單獨(dú)診斷（Z=2.616、3.719，P<0.05）。見表5、圖1。

表5 血清miR?126、IGF?1 表達(dá)對(duì)DM 前期結(jié)腸息肉的診斷價(jià)值Table 5 The diagnostic value of serum miR?126 and IGF?1 expression in colonic polyps in pre DM

圖1 血清miR?126、IGF?1 表達(dá)對(duì)DM 前期結(jié)腸息肉的診斷價(jià)值Figure 1 The diagnostic value of serum miR?126 and IGF?1 expression in colonic polyps in pre DM

3 討論

miRNA 是一個(gè)小型非編碼RNA 家族，在調(diào)節(jié)血糖水平和DM 中起著至關(guān)重要的作用［7］。血漿miR?126 表達(dá)水平與某些血糖和脂質(zhì)指數(shù)顯著相關(guān)，可作為DM 生物標(biāo)志物［8］。王鳳等［9］認(rèn)為miR?126 表達(dá)上調(diào)，可抑制白細(xì)胞黏附、限制炎癥細(xì)胞召集，降低血小板的活化和聚集，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，miR?126 具有作為血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物的潛能，同時(shí)miR?126 是缺血相關(guān)血管生成和修復(fù)信號(hào)的重要潛在靶點(diǎn)和調(diào)節(jié)位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，正常息肉組患者血清miR?126 表達(dá)水平較正常無息肉組高，與Thorlacius?Ussing 等［10］研究相似，提示miR?126 與結(jié)腸息肉的發(fā)生有關(guān)，猜測(cè)其可能參與結(jié)腸息肉形成的血管構(gòu)建。DM 前期結(jié)腸息肉與無結(jié)腸息肉患者miR?126 水平均高于糖耐量正常者，提示miR?126 與DM 前期的發(fā)生也有關(guān)，原因可能為：DM 前期過程中機(jī)體為適應(yīng)胰島素紊亂等多種失衡機(jī)制，可能發(fā)生某些炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致miR?126 水平升高。本研究還發(fā)現(xiàn)，DM 前期息肉組血清miR?126 表達(dá)水平較正常無息肉組、正常息肉組、DM 前期無息肉組顯著升高，因此研究猜測(cè)miR?126 可能在DM 前期結(jié)腸息肉發(fā)病過程中扮演著重要角色。

IGF?1 是一種肽生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡［11?12］。有研究顯示，DM 患者患結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)高于無DM 者，在IGF?1 水平高于183.5 ng/mL 時(shí)，患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著提高［13］。Parolin 等［14］發(fā)現(xiàn)，肢端肥大癥患者結(jié)腸息肉的發(fā)生與IGF?1、空腹血糖水平顯著相關(guān)。陳娟等［15］發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者血清IGF?1 表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組。本研究中，正常息肉組患者血清IGF?1 表達(dá)水平較正常無息肉者高，與Parolin 等［14］研究具有類似性，提示IGF?1 可能與結(jié)腸息肉的發(fā)生有關(guān)。DM 前期結(jié)腸息肉與無結(jié)腸息肉患者血清IGF?1表達(dá)水平均較糖耐量正常者高，提示IGF?1 高表達(dá)可能參與DM 前期慢性炎癥刺激，加劇炎性反應(yīng)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，DM 前期息肉組血清IGF?1 表達(dá)水平較糖耐量正常者、DM 前期無息肉組顯著升高，猜測(cè)IGF?1 水平升高可能在DM 前期結(jié)腸息肉發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用，具體作用機(jī)制需后期繼續(xù)探討。

本研究Pearson 分析顯示，DM 前期結(jié)腸息肉患者血清中miR?126 與IGF?1 呈正相關(guān)，提示兩者可能在DM 前期炎性反應(yīng)過程中存在某種共同調(diào)節(jié)機(jī)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高危結(jié)腸息肉組血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平高于低危結(jié)腸息肉組，提示miR?126、IGF?1 表達(dá)或與結(jié)腸息肉危險(xiǎn)程度相關(guān)。進(jìn)一步繪制了ROC 曲線，結(jié)果顯示血清miR?126、IGF?1 均可作為診斷DM 前期結(jié)腸息肉的血清指標(biāo)，且兩者聯(lián)合診斷價(jià)值與可靠性更高。提示，在血清miR?126、IGF?1 表達(dá)水平升高的DM 前期人群中，需警惕結(jié)腸息肉惡變的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，miR?126、IGF?1 在DM 前期發(fā)生結(jié)腸息肉患者血清中均呈高表達(dá)，miR?126、IGF?1 具有一定相關(guān)性，對(duì)診斷DM 前期患者結(jié)腸息肉有一定的診斷價(jià)值，兩者聯(lián)合診斷價(jià)值更高。