尿液肌氨酸在前列腺癌中的應(yīng)用及檢測(cè)

周斌 胡晞江

前列腺癌（prostate carcinoma，PCa）發(fā)病率在臨床上位于男性惡性腫瘤的第二位，且在中國呈逐年上升趨勢(shì)［1］，PCa 早診斷、早治療尤為重要，目前PCa 早期篩查主要依靠直腸指檢聯(lián)合血液前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）檢測(cè)，但其存在一定程度的“灰區(qū)”和假陽性結(jié)果，造成過度治療和漏診（靈敏度為20.5%、特異性為51%～91%）［2?3］，因此在臨床上迫切需要特異和敏感的生物標(biāo)志物及其準(zhǔn)確且靈敏的檢測(cè)方法。

尿液前列腺癌抗原3（prostate cell antigen 3，PCA3）、早期前列腺抗原（early prostatecancer anti?gen，EPCA）、前列腺干細(xì)胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）、α?甲酰輔酶A 消旋酶（alpha?meth?ylacyl?coa racemase，AMACR）等生物標(biāo)志物逐步走進(jìn)了大眾的視野［4?5］，但是由于其檢測(cè)手段有限，限制了在臨床上的使用。近年來通過代謝組學(xué)逐漸發(fā)現(xiàn)包括肌氨酸、丙氨酸、精氨酸、尿嘧啶、谷氨酸、富馬酸、檸檬酸和絲氨酸等多種代謝產(chǎn)物有望被用作PCa 患者生物標(biāo)志物［6?7］，其中肌氨酸是最早被篩選和證實(shí)的［8］。對(duì)于這些新型生物標(biāo)志物推廣至臨床應(yīng)用還需進(jìn)行嚴(yán)密評(píng)估及確證，使科研向臨床轉(zhuǎn)化。本文主要綜述肌氨酸的臨床應(yīng)用價(jià)值和近十年來尿液中肌氨酸的檢測(cè)方法，為醫(yī)務(wù)工作者及科研工作者提供參考依據(jù)。

1 肌氨酸的臨床應(yīng)用價(jià)值

肌氨酸，即N? 甲基甘氨酸，化學(xué)式為CH3NHCH2COOH，末端含羧基，溶于水，是膽堿代謝為甘氨酸過程的中間體。自2009年研究者首次揭示肌氨酸是PCa 發(fā)展時(shí)顯著增高的代謝產(chǎn)物后［8］，又陸續(xù)開展了眾多研究以期評(píng)估肌氨酸作為PCa 生物標(biāo)志物的價(jià)值。少量研究顯示，尿液中的肌氨酸不能用于鑒別前列腺相關(guān)疾病。Jentzmik發(fā)現(xiàn)直腸指診與尿液中肌氨酸聯(lián)合使用并不比PSA 更容易區(qū)分PCa 和非PCa，且肌氨酸濃度與評(píng)分無相關(guān)性［9］。大部分研究認(rèn)為：尿肌氨酸不僅能作為前列腺疾病早期篩查、病理分級(jí)及預(yù)后判斷的關(guān)鍵指標(biāo)，還能有效反映PCa 的侵襲性，辨別癌細(xì)胞是緩慢生長還是高度侵襲生長，其檢測(cè)診斷PCa 的準(zhǔn)確性優(yōu)于血PSA 檢測(cè)［8，10］。Wang 等［11］也進(jìn)一步證實(shí)了尿肌氨酸/肌酐比值不僅可區(qū)分良性前列腺增生性疾病和PCa，還可在PSA 灰色區(qū)（PSA<10 ng/mL）水平時(shí)作為PCa 生物標(biāo)志物，而且還發(fā)現(xiàn)肌氨酸濃度水平與Gleason 評(píng)分密切相關(guān)。上述結(jié)果說明，肌氨酸在檢出PCa 以及判斷PCa 侵襲性方面至少與PSA 相當(dāng)，甚至更優(yōu)。也有研究者推測(cè)，將PSA 檢測(cè)和一些新的生物標(biāo)志物如肌氨酸等結(jié)合起來，可使PCa 的診斷、治療和監(jiān)測(cè)更個(gè)體化，最重要的是在活檢之前就能預(yù)判前列腺病變的嚴(yán)重程度，減少不必要的穿刺活檢。

綜上所述，尿液肌氨酸檢測(cè)在前列腺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值目前存在爭(zhēng)議，導(dǎo)致出現(xiàn)爭(zhēng)議的原因可能與尿液肌氨酸檢測(cè)方法、測(cè)定樣本（尿沉渣或經(jīng)尿液離心后的上清液）、受試人群等差異有關(guān)［12］。不同GNMT遺傳背景可影響人群中肌氨酸水平［13］，而且樣品預(yù)處理方法和檢測(cè)方法都可能影響檢測(cè)結(jié)果［12，14］。因此，樣品前處理和檢測(cè)對(duì)肌氨酸在臨床上的應(yīng)用非常重要。

2 肌氨酸檢測(cè)方法

肌氨酸要達(dá)到臨床應(yīng)用必須依賴準(zhǔn)確，且快速的檢測(cè)方法，目前肌氨酸檢測(cè)方法種類繁多，主要包括間接定量分析和直接檢測(cè)兩大類。間接定量分析是通過肌氨酸氧化酶或納米酶氧化肌氨酸間接檢測(cè)，主要包括比色法［15］，熒光法［16］和電化學(xué)方法［17］。2007年以來隨著納米酶催化體系的不斷發(fā)展，肌氨酸比色法中基于納米酶的生物傳感器逐漸增多，大大優(yōu)化了比色法的檢測(cè)性能。直接檢測(cè)方法通常包括色譜法、色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法［18］以及電化學(xué)方法［17］。這類方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性都非常好，但暫未能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的快速批量檢測(cè)，電化學(xué)方法靈敏度也有待提高。隨著分子印跡技術(shù)在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用，其檢測(cè)性能均達(dá)到了新的高度。

2.1 分光光度法

傳統(tǒng)的分光光度法主要依賴的是肌氨酸氧化酶，這是最早開發(fā)和最經(jīng)典的檢測(cè)方法之一，目前已有成熟檢測(cè)試劑盒和專利誕生，該方法操作簡單，成本低，也不受丙氨酸干擾，但在低濃度尿液加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中回收率較低。隨著材料科學(xué)的迅猛發(fā)展，越來越多的人工模擬酶如貴金屬絡(luò)合物和金/銀納米顆粒等有望替代傳統(tǒng)酶用于分析檢測(cè)中，納米酶的應(yīng)用也是肌氨酸比色檢測(cè)未來發(fā)展方向。納米酶既具有納米材料優(yōu)異的理化特性，良好的相容性，合成簡單，易修飾和無毒，又兼具極佳的酶學(xué)催化功能，可避免酶修飾和分離步驟，也能減少蛋白酶的非特異性吸附。早期在Pd 納米顆粒合成中引入碳納米管，石墨烯等納米顆粒增強(qiáng)模擬酶活性，改善生物親和力，使方法的檢出限降至5.0 nmol/L［19］。BawaMbage 等人以自制的葉酸官能團(tuán)化的多金屬氧酸鹽化合物為模擬酶，實(shí)現(xiàn)肌氨酸和雙氧水同時(shí)檢測(cè)，但檢出限較高（0.311 μmol/L）［20］。

2.2 電化學(xué)分析法

尿液中肌氨酸的含量極低（健康成人為1～1.5 μmol/L），常規(guī)的電化學(xué)生物傳感器的靈敏度和選擇性并不都能滿足臨床需求［17，21］。近年來，研究者們一方面致力于改善肌氨酸氧化酶活性，通過新型材料的合成或結(jié)構(gòu)改善實(shí)現(xiàn)活性生物物質(zhì)固定在基體電極表面保證接觸面積最大化，達(dá)到酶催化活性增強(qiáng)目的。比如，Yang 等［22］合成鉑負(fù)載介孔磷酸鎳增加活性位點(diǎn)，對(duì)肌氨酸氧化酶產(chǎn)物具有良好的電化學(xué)性能，在定量分析肌氨酸時(shí)檢出限為0.24 μmol/L。Yang 等以類沸石咪唑酯骨架材料（zeoliticimidazolate framework?8，ZIF?8）負(fù)載納米鉑（Pt@ZIF8），將其修飾在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）上（Pt@ZIF8/GCE），ZIF?8獨(dú)特的3D 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提高了鉑納米顆粒對(duì)肌氨酸氧化酶的電催化活性，維持檢出限在1.06 μmol/L水平，線性范圍為5～30 μmol/L［23］。另一方面研究者們利用分子印跡聚合物對(duì)模板分子的良好識(shí)別機(jī)制，實(shí)現(xiàn)肌氨酸檢測(cè)中出色的選擇性和穩(wěn)定性［24］，比如，Sheydaei Omid 等［25］利用新型納米分子印跡聚合物修飾碳糊電極建立了微分脈沖伏安法，以甲基丙烯酸為功能單體，乙腈水溶液為致孔劑，通過溶膠?凝膠法制備分子印跡聚合物納米珠，納米珠結(jié)構(gòu)在碳糊電極上良好的電催化作用，實(shí)現(xiàn)了肌氨酸定量分析的高親和性和高選擇性，但該方法同樣沒有呈現(xiàn)優(yōu)異的檢出限（0.38 μmol/L）。?zkütük 等［26］以甲基丙烯酰胺基組氨酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，通過乳液聚合合成分子印跡聚合物，該分子印跡聚合物電位傳感器平臺(tái)對(duì)肌氨酸顯示出高選擇性，且響應(yīng)時(shí)間短（<2 min），線性范圍寬（10?5～10?9mol/L）。也有研究者把磁性Fe3O4納米粒子嵌入金屬有機(jī)骨架化合物作為分子印跡化合物載體，利用金屬有機(jī)骨架的多孔結(jié)構(gòu)提高傳質(zhì)效率和吸附能力，印跡因子達(dá)4.30，使檢測(cè)肌氨酸的檢測(cè)限降至0.4 pmol/L，線性范圍為1～100 pmol/L［27］。所以，電化學(xué)方法可通過改變模板分子的結(jié)構(gòu)或基于復(fù)合材料創(chuàng)建多層分子印跡聚合物來設(shè)計(jì)聚合物的整體形態(tài)以此提高選擇性和靈敏度。雖然分子印跡技術(shù)在電化學(xué)傳感器中已經(jīng)獲得了良好應(yīng)用，但仍然存在機(jī)理研究不夠深入，制備技術(shù)有待優(yōu)化等亟待解決的問題。

2.3 色譜法或色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法

質(zhì)譜法是氨基酸定量檢測(cè)的最準(zhǔn)確的方法之一。肌氨酸結(jié)構(gòu)上帶有氨基和羧基，是一種分子量較小的親水物質(zhì)，在電噴霧離子源中肌氨酸離子化效率較低，直接用質(zhì)譜法信號(hào)較弱，通常需要與氣相色譜、液相色譜和毛細(xì)管電泳聯(lián)合使用［28］。目前肌氨酸檢測(cè)的色譜法主要以高效液相色譜為主，而氣相色譜使用較少（需要合適的衍生化試劑衍生）。尿液中存在內(nèi)源性丙氨酸，其濃度是肌氨酸的數(shù)千倍，在常規(guī)色譜法或色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法中不能有效分離肌氨酸及其分子異構(gòu)體（α?L?丙氨酸，α?D?丙氨酸和β?丙氨酸）。近年來，通過合適的衍生化等手段逐步可排除丙氨酸的干擾。如Tang?Chia Chung 等人利用熒光試劑左氧氟沙星酰氯衍生化，以乙酸鈉緩沖液和四氫呋喃作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在己基?苯基柱上能較好的分離氨基酸衍生物與其分子異構(gòu)體，線性范圍為44.5～1780.0 ng/mL，檢出限為8.9 ng/mL［18］。研究者利用丹磺酰氯進(jìn)行柱前衍生，在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上通過提高分辨率和離子化效率，使衍生后肌氨酸及丙氨酸保留時(shí)間延長以達(dá)到分離目的［29］。高效液相色譜?質(zhì)譜或氣相色譜?質(zhì)譜法能對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的肌氨酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，重復(fù)性好，且有極高的分辨率和分析效率，值得注意的是質(zhì)譜法需要昂貴的儀器設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)品和固相萃取等樣品前處理手段。所以在今后要實(shí)現(xiàn)臨床意義上的色譜?質(zhì)譜法常規(guī)檢測(cè)肌氨酸，應(yīng)該更著重樣品前處理方法的簡化以及臨床操作的標(biāo)準(zhǔn)化。

2.4 熒光光譜法

肌氨酸本身不具有熒光，必須利用熒光染料等試劑與其相互作用生成絡(luò)合物再進(jìn)行測(cè)定。研究者利用鑭系金屬有機(jī)骨架出色的光學(xué)特性［30］，將Tb3+和Cu2+引入到金屬有機(jī)骨架中設(shè)計(jì)了發(fā)光探針，通過肌氨酸與Cu2+之間的強(qiáng)相互作用來影響傳感器的發(fā)光性質(zhì)，檢出限為0.23 μmol/L［16］。近兩年也報(bào)道了基于核酸適體的熒光光譜法，肌氨酸核酸適體于2018年首次合成，對(duì)肌氨酸具有嚴(yán)格的識(shí)別行為和高度的親和力（解離常數(shù)為134.8±1.12 nmol/L），用于肌氨酸檢測(cè)，不受內(nèi)源性丙氨酸干擾［31］。2019年Canan ?zyurt 等［31］使用氧化石墨烯輔助的配體指數(shù)富集技術(shù)又篩選了兩個(gè)特異性的DNA 核酸適體9S 和13S，顯著降低了解離常數(shù)，相比2018年報(bào)道的核酸適體熒光法，其檢出限降低了5 個(gè)數(shù)量級(jí)，低至0.5 pmol/L，是現(xiàn)有檢測(cè)方法中檢出限最低的方法，線性范圍達(dá)到6 個(gè)數(shù)量級(jí)，核酸適體的應(yīng)用避免了復(fù)雜繁瑣的衍生和樣品預(yù)處理步驟［32］。

3 小結(jié)與展望

本文綜述了肌氨酸在前列腺癌早期篩查和等級(jí)評(píng)分中的應(yīng)用價(jià)值及近十年來的檢測(cè)方法。肌氨酸定量方法種類多，早期不同的檢測(cè)方法的結(jié)果差異性大，而且全自動(dòng)化檢測(cè)方法較少，嚴(yán)重制約了肌氨酸在臨床上的應(yīng)用。比色法有成品的試劑盒，操作簡便，對(duì)儀器設(shè)備要求不高，適合醫(yī)院大規(guī)模檢測(cè)，未來應(yīng)該更多的開發(fā)納米酶的潛在應(yīng)用價(jià)值。色譜?質(zhì)譜檢測(cè)方法難以在基層單位開展，其需要昂貴的檢測(cè)費(fèi)用和特殊的專業(yè)技術(shù)操作人員，但準(zhǔn)確性和重復(fù)性都非常好。電化學(xué)方法近年來通過使用分子印跡聚合物等極大降低了肌氨酸檢測(cè)的檢出限，并提高了選擇性，電化學(xué)方法和熒光光譜法未來應(yīng)該朝連續(xù)、自動(dòng)化、快速和計(jì)算機(jī)方向發(fā)展，通過自動(dòng)化儀器向醫(yī)院推廣。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測(cè)目的和自身實(shí)驗(yàn)室條件選擇合適的檢測(cè)方法，建立普通人群和前列腺相關(guān)疾病的肌氨酸數(shù)據(jù)庫，提高肌氨酸生物標(biāo)志物早期篩查的靈敏度和準(zhǔn)確性。總之，如何選擇和互補(bǔ)不同的檢測(cè)方法，改善檢測(cè)方法的性能參數(shù)，提高肌氨酸檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值是檢驗(yàn)工作人員一致的追求方向。