數字聚合酶鏈式反應在檢驗診斷中的應用進展

劉雅楠 張彤 趙國強 魏鳳香，3★

自1983年PCR 這一革命性技術誕生以來，這種核酸分析方法一直處于檢測領域的領先地位。隨著分子生物技術的不斷發展，PCR 技術不僅局限于體外無限擴增目的基因，而是從定性向更精確的定量轉變。數字聚合酶鏈式反應（digital poly?merase chain reaction，dPCR）作為一種新的DNA定量技術，具有比傳統PCR 更快、更精準、重復性更好的特性，已逐漸成為生命科學領域最引人矚目的創新之一，并在檢驗診斷中快速推廣。該技術不僅可用于臨床診斷和結果驗證，還可用于疾病隨訪和療效觀察，在疾病發現和治療方面具有很大優勢，對提高國民健康水平具有很高的發展前景和研究價值。本文總結了最近幾年dPCR 技術在檢驗中的應用進展和優勢。

1 技術原理和優勢

dPCR 是結合了傳統PCR 簡單操作的特征和實時熒光定量PCR 準確定量的特征發展而來的第三代PCR 技術［1］。同傳統PCR 相比，dPCR 增加了對反應體系進行分隔的操作，將幾十微升的反應體系分隔成了數萬微小獨立反應體系，核酸模板在這種分隔過程中被充分稀釋，理想狀態下每個微滴中含有1 個分子的核酸模板，擴增完成后對所有的液滴進行熒光信號識別并計數，通過泊松分布原理計算靶標分子的濃度。基于分液形式的不同，dPCR 主要分為3 種：微流體數字PCR（microfluidic digital PCR，mdPCR）、液滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和芯片數字PCR（chip digital PCR，cdPCR）。與傳統的核酸擴增技術相比，dPCR 不需要內參基因，不依賴擴增閾值（cycle threshold，CT）和標準曲線，dPCR 擴增效率不影響結果，可以絕對定量核酸分子［2］。近年來，推出的最新使用指南：數字定量PCR 實驗數據和發表文章所必須的最低限度標準指南（the digital MIQE guidelines：minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments，dMIQE）［3］，使dPCR 的實驗方法更標準化，實驗結果可靠性和準確性不斷提高［4］，dPCR 技術在基因突變檢測、拷貝數變異檢測、病毒微生物檢測、轉基因食品檢測以及測序等方面均得到廣泛的應用［5］。

2 dPCR 技術在檢驗中的應用

2.1 dPCR 在腫瘤研究和診斷方面的應用

dPCR 技術具有高靈敏度、高準確性的特點，在微量樣本的檢測中發揮重要作用。該技術不僅能實現樣本核酸的檢測和定量，還能發現新的腫瘤標志物、研究核酸功能作用［6］。血液或其他體液中的循環核酸、循環腫瘤細胞DNA、微小核糖核酸等常作為檢測對象。

在急性髓系白血病的診療中，體細胞基因突變是重要的預后標志物和治療靶標。Rausch 等［7］研發了一種新型的ddPCR 檢測設計——“double drop?off”（DDO?ddPCR），可以檢測目標DNA 分子的兩個相鄰突變熱點區域中的異質性變化，可用于突變篩選以及定量檢測。實驗證明，DDO?ddP?CR 檢測具有較高的一致性和靈敏度，將DDO?ddPCR 用于檢測血漿游離DNA 可以診斷急性髓系白血病，監測長期靶點特異性療法效果，評估化療期間的早期反應，以及確定髓外疾病患者的體細胞基因突變。但是這種方法的臨床適用性還需要更大規模的前瞻性研究來驗證。

在唾液沖洗液等復雜樣本中檢測核酸面臨著“能否檢測出”和“是否檢測準”這兩個巨大的挑戰。有研究表明miRNA 的表達水平和DNA 甲基化與腫瘤的發生、發展有著密切的關系［8］。Fung等［9］利用ddPCR 技術定量檢測頭頸部鱗狀細胞癌患者唾液沖洗液中的PAX5、EDNRB 和DCC 甲基化靶標，將未甲基化的正常DNA 濃度稀釋至0.01%，降低檢測濃度下限，使得背景低甲基化信號與腫瘤衍生的高甲基化信號區分開，從而提高檢測靈敏度。ddPCR 為檢測非靶標分子池中的有限靶標提供了更高的分辨率，這種方法還可以對目標分子進行絕對定量而不需要外部參考標準基線。有多項研究表明同時檢測多種分子畸變可能對惡性腫瘤的診斷有協同作用［10?11］。已經證明，dPCR 可以絕對定量、簡化實驗，但是dPCR 同時檢測多種類型的分子靶點重復性較差［12?13］。為了優化檢測方法，Li 等［12］使用ddPCR 結合96 微孔板開發了一種可以高通量檢測多個miRNAs 和DNA 甲基化生物標志物。基于微孔板的ddPCR 檢測技術可以絕對、重復、高靈敏度地定量15 個miRNAs 和14 個DNA 甲基化位點。通過實驗證明，微孔板ddPCR 技術使可以高通量檢測并量化痰和血漿中多種分子畸變，提高肺癌的早期診斷率。以上研究表明在低靶標濃度的復雜樣本中，ddPCR 在直接定量標志物方面具有明顯的優勢，為腫瘤研究和診斷提供了重要的技術支持。

2.2 dPCR 在產前診斷中的應用

傳統的產前診斷是通過羊膜穿刺術和絨毛膜絨毛取樣進行的，這種侵入式采樣方法容易對胎兒造成創傷，使孕婦流產的風險增大。dPCR 可以對母體血漿中游離胎兒DNA 進行精確分析，被廣泛用于非侵入性產前篩查，是一種安全、快捷、準確的產前診斷新技術［14］。

Caswell 等［15］對血漿游離DNA 樣本進行ddPCR檢測，以量化母體GCK 或HNF4A 變異體的等位基因，再利用Bayesian MCMC 概率分數模型結合ddPCR 數據和胎兒分數分析預測胎兒基因型。該方法與目前僅有56%～72%準確率的超聲掃描法預測母系遺傳單基因疾病的胎兒基因型相比，靈敏度和準確性方面有很大改進，在單胎糖尿病妊娠巨大兒的風險管理中具有很強的適用性。

近兩年，基因分型技術得到了突飛猛進的發展，越來越多的臨床和科研成果不斷涌現出來，但是dPCR 技術卻有著不可替代的地位。在80%以上的報告病例中，抗血小板HPA?1a 抗原是引起胎兒和新生兒同種免疫血小板減少癥的原因［16］。Mammasse 等［17］利用ddPCR 技術同時擴增四種血小板抗原系統預測的胎兒HPA 基因型，所有胎兒和新生兒同種免疫性血小板減少癥病例組基因型均在羊膜穿刺術或分娩后得到驗證。實驗結果證實，ddPCR 是一種靈敏、準確、安全、非侵入性檢測方法，可以預測胎兒血小板抗原基因分型，有助于識別有風險的孕婦，加強產前管理。Vodicka 等［18］分析比較實時熒光定量PCR、微測序和ddPCR 方法在RHD 胎兒無創性基因分型中的應用，結果顯示：ddPCR 的準確性與實時熒光定量PCR 相當，但是靈敏度更高；與微測序方法相比，ddPCR 僅在半個工作日內便可完成。在基因分型檢測方面，ddP?CR 可以對母體胎兒游離DNA 的數量進行準確的測量和定量，重復性較好，從而將假陰性結果的可能性降到最低。

dPCR 檢測不僅可以精準地預測基因分型，在常染色體遺傳病的檢測中也得到了廣泛的應用。脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）在新生兒中的發病率約為1∶3 900～1∶16 000［19］。Noemi等［20］利用ddPCR 方法檢測1 530 名患者干血點中運動神經元存活基因1（spinal motor neurons?1，SMN1）缺失和SMN2拷貝數變化，并同時測定SMN1、SMN2 和核糖核酸酶P/MRP30k Da 亞基濃度，當拷貝個體≥1 SMN1 時，批次內和批次間不確定度的變異系數<7.1%。檢測12 例SMA 陽性樣本的敏感性和特異性均為100%，ddPCR 方法靈敏度高、特異性強，適用于SMA 新生兒篩查和載體狀態測定。

2.3 dPCR 在病毒檢測和預后治療方面的應用

病毒載量是持續性病毒感染的重要決定因素，往往與疾病的預后和復發相關。Rutsaert 等［21］分別用dPCR 和RT?qPCR 檢測病毒載量變化，監測艾滋病疾病進展。結果顯示與RT?qPCR 相比，dPCR 能夠對核酸進行高靈敏度檢測和對靶點進行直接絕對定量，可以量化持續存在的低濃度病毒。隨著dPCR 技術的不斷發展，它很可能成為艾滋病毒研究與診斷中不可或缺的檢測工具。

準確檢測出低濃度的復制殘留的中間價閉合環DNA（covalently closed circular DNA，cccD?NA），是判斷HBV 是否治愈的重點［22］。Bao 等［23］利用dPCR 技術以過量松弛環狀雙鏈DNA 為背景，精確定量肝細胞中穩定增殖的HBV cccDNA未發現假陽性。與傳統PCR 方法相比，dPCR 方法最低檢測濃度降低1 000 倍。dPCR 大大提高了cccDNA 檢測的敏感性和特異性，可用于篩選有效的cccDNA 抑制劑。

HPV 病毒載量是病毒持久性的重要決定因素［24］，不同HPV 基因型的病毒載量檢測對預測宮頸癌發生率至關重要。Malin 等［25］利用ddPCR 對福爾馬林固定石蠟嵌入組織和宮頸液細胞學樣本的DNA 進行病毒載量分析，比較多重HPV 感染和單發HPV 感染的腫瘤之間病毒載量的差異，結果顯示ddPCR 可以高靈敏度地絕對定量不同HPV基因型的病毒載量，ddPCR 可能成為預測疾病進展或復發的有效監測工具。

早期篩查出陽性的核酸樣本對于預防和控制新冠肺炎病毒感染至關重要［26］，但是，也有報道稱新冠肺炎出院患者中出現了SARS?CoV?2 復發，可能是檢測結果假陰性以及病毒的重新激活或再次感染。最近，有報道稱與RT?qPCR 相比，dPCR 在檢測SARS?CoV?2 低病毒載量方面顯示出更高的敏感性和特異性［27］。Sun 等［28］使用dPCR 技術對臨床復發的新冠肺炎患者定量檢測SARS?CoV?2，分析低病毒載量標本的檢測效果。結果表明，與RT?qPCR 相比，dPCR 對SARS?CoV?2 模擬樣本和臨床樣本的低病毒載量具有更高的敏感性，并能準確反映病毒RNA 拷貝數的變化。與傳統PCR相比，在SARS?CoV?2 復發樣本和假陰性以及病毒的重新激活或再次感染樣本中，dPCR 檢測更具優勢［29?30］。dPCR 對SARS?CoV?2 與其他呼吸道病原體如普通流感病毒或其他人類冠狀病毒的鑒別也顯示出很高的特異性。

綜上所述，dPCR 具有高特異性和高靈敏度的特點，與RT?qPCR 相比，該技術的主要優點是定量分析精度高、可靠性強、重現性好，可實現復雜目標序列的大規模平行單分子擴增。這項技術可以在臨床生物學實驗室、臨床檢驗診斷以及幾乎所有學科中使用，特別適用于對低豐度的或抑制劑存在的復雜環境中的核苷酸序列定量檢測。

3 小結與展望

dPCR 雖然實用性強，應用范圍廣，但是還存在一些局限和不足：①高靈敏度的dPCR 技術在受到外源性污染時會造成假陽性結果。②當反應分子池單元達到飽和狀態時，樣品濃度越高，檢測精度越低，所以需要優化稀釋方法，以滿足對樣本持續檢測的能力。③相比于傳統PCR，dPCR 的成本高出幾十倍。④每個反應池理論上希望最多存在一個核酸模板，然而實際操作中卻通常含有2 個及2 個以上的核酸模板，導致基因拷貝數的偏移。為了提高dPCR 的準確性、適用性，彌補現存的不足，應首先在實驗室內進行標準質控驗證，再進行實驗室間的質控標準化確認。其次可以優化dPCR技術操作方法，提高對靶標檢測的準確性和實驗目的的適用性，如上文所述應用96 微孔板等優化操作過程，或與NGS 測序、質譜、恒溫擴增技術等多種技術相結合擴展應用范圍。最后，dPCR 技術還在不斷完善，適用的范圍也將逐漸擴大，與其他檢測技術的結合將更為緊密，期望dPCR 在基礎研究和應用方面發揮更大的作用。