血清Galectin?9和PD?L1對慢性乙型肝炎肝臟炎癥程度的診斷價值

賈夢山 劉加敏 楊艷霞

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的世界性傳染病。我國是CHB 高發(fā)國家，據(jù)統(tǒng)計，我國每年死于CHB相關(guān)肝硬化、肝癌等疾病的人高達100 多萬［1?2］。目前，評價肝臟病理狀態(tài)仍是CHB 基礎(chǔ)與臨床研究的熱點問題。肝臟炎癥是CHB 發(fā)展至肝硬化、肝癌的病理基礎(chǔ)［3］。因此，早期診斷CHB 肝臟炎癥程度具有重要臨床意義。CHB 病機主要是免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝損傷，機體免疫水平與病情進展及預(yù)后密切相關(guān)［4］。半乳糖凝集素?9（Galectin?9）是T 細胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白?3（Tim?3）配體，研究表明，Tim?3/Galectin?9 信號通路活化可抑制T 細胞活化及Th1 免疫［5］。相關(guān)研究已證實，Galectin?9 在多種自身免疫性疾病、炎性疾病、腫瘤等發(fā)生及進展過程中起到重要作用［6］。程序性死亡受體?配體1（Programmed death ligand?1，PD?L1）是程序性死亡受體?1（PD?1）主要配體，可負向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，近年來，其在CHB 患者免疫調(diào)節(jié)中的作用日益受到重視［7］。目前，關(guān)于血清Galectin?9、PD?L1 對CHB 肝臟炎癥程度的診斷價值，臨床研究較少。本研究對此展開探討，旨在為臨床提供數(shù)據(jù)支持。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月至2021年7月周口市疾控中心專科病醫(yī)院CHB 患者126 例為觀察組，同期選取45 名健康體檢者為對照組。觀察組納入標準：均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［8］中CHB 診斷標準；患者及家屬知情同意。對照組納入標準：病毒性肝炎抗體、肝腎功能、血常規(guī)、腹部彩超、腫瘤系列等體檢均正常；入試者均知情同意。排除標準：曾接受干擾素?α 類、核苷（酸）類等藥物治療；其他病毒性肝炎；自身免疫性肝病；失代償期肝硬化；惡性腫瘤；凝血功能障礙；妊娠或哺乳期女性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床特征收集

包括年齡、性別、肝功能指標、HBV?DNA、肝臟炎癥分級、纖維化分期［9］等。HBV?DNA 及肝功能指標［谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Aspar?tate transaminase，AST）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（Total bilirubin，TBil）、凝血酶原時間（Pro?thrombin time，PT）、白蛋白（Albumin，Alb）］采用羅氏全自動生化分析儀檢測；炎癥活動度分級（G）為0～4 級，輕度肝臟炎癥（G0+G1），顯著肝臟炎癥（G2+G3+G4）；肝纖維化分期（S）為0～4 期，輕度肝纖維化（S0+S1），顯著肝纖維化（S2+S3+S4）。觀察組HBV?DNA 為（8.27±1.09）×103拷貝/mL；炎癥分級：G0=23 例，G1=47 例，G2=34 例，G3=18 例，G4=4例；纖維化分期：S0=47 例，S1=40 例，S2=32 例，S3=5 例，S4=2 例。

1.2.2 血清Galectin?9、PD?L1 檢測

采集空腹肘靜脈血3 mL，離心（時間15 min，半徑8 cm，轉(zhuǎn)速3 500 r/min），取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定Galectin?9，上海紀寧生物制劑公司試劑盒；采用流式細胞儀檢測PD?L1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，計量資料以（）描述，t檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，χ2檢驗；影響因素采用Logistic 回歸分析；采用Spearman、Pearson 分析相關(guān)性；診斷價值采用受試者工作特征（ROC）曲線，獲取AUC、置信區(qū)間、敏感度、特異度，聯(lián)合預(yù)測實施Logistic 二元回歸擬合，返回預(yù)測概率logit（p），將其作為獨立檢驗變量。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床特征及血清Galectin?9、PD?L1 水平

兩組年齡、性別、肝功能指標（AST、ALT、TBil、PT、Alb）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；觀察組血清Galectin?9、PD?L1 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組臨床特征及血清Galectin?9、PD?L1 水平［n（%），（±s）］Table 1 Clinical characteristics and serum levels of Galectin?9 and PD?L1 in the two groups［n（%），（±s）］

表1 兩組臨床特征及血清Galectin?9、PD?L1 水平［n（%），（±s）］Table 1 Clinical characteristics and serum levels of Galectin?9 and PD?L1 in the two groups［n（%），（±s）］

指標觀察組（n=126）對照組（n=45）t/χ2值P 值年齡≥40 歲<40 歲性別58（46.03）68（53.97）21（46.67）24（53.33）0.005 0.942男女0.058 0.809肝功能指標AST（U/L）ALT（U/L）TBil（μmol/L）PT（s）Alb（g/L）HBV?DNA（×103拷貝/mL）Galectin?9（ng/mL）PD?L1（%）73（57.94）53（42.06）33.31±7.25 32.58±8.96 16.94±5.06 12.84±1.36 40.61±3.87 8.27±1.09 1.92±0.55 1.52±0.34 27（60.00）18（40.00）32.79±6.84 31.55±8.43 16.31±4.28 12.62±1.13 41.15±4.16 0.419 0.672 0.745 0.972 0.788 0.676 0.503 0.457 0.333 0.432 0.33±0.15 0.38±0.17 19.108 21.523<0.001<0.001

2.2 CHB 患者血清Galectin?9、PD?L1 水平與主要臨床特征相關(guān)性

CHB 患者血清Galectin?9、PD?L1 水平與HBV?DNA、炎癥分級、纖維化分期均呈正相關(guān)（P<0.05）。見表2。

表2 CHB 患者血清Galectin?9、PD?L1 水平與主要臨床特征相關(guān)性Table 2 Correlations between serum Galectin?9 and PD?L1 levels and main clinical characteristics in CHB patients

2.3 CHB 患者顯著肝臟炎癥單因素分析

126 例CHB 患者中，輕度肝臟炎癥（G0+G1）69 例，顯著肝臟炎癥（G2+G3+G4）57 例。HBV?DNA、Galectin?9、PD?L1 均為CHB 患者顯著肝臟炎癥相關(guān)因素（P<0.05）。見表3。

2.4 CHB 患者顯著肝臟炎癥多因素Logistic 回歸分析

以CHB 患者肝臟炎癥程度為因變量（賦值：輕度肝臟炎癥=1，顯著肝臟炎癥=2），將表3中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的項作為自變量（賦值：實際值），應(yīng)用Logistic 回歸模型分析，結(jié)果顯示，HBV?DNA 及血清Galectin?9、PD?L1 水平升高均為CHB 患者顯著肝臟炎癥獨立危險因素（P<0.05）。見表4。

表3 CHB 患者顯著肝臟炎癥單因素分析［n（%），）（±s）］Table 3 Univariate analysis of significant liver inflammation in CHB patients［n（%），）（±s）］

表3 CHB 患者顯著肝臟炎癥單因素分析［n（%），）（±s）］Table 3 Univariate analysis of significant liver inflammation in CHB patients［n（%），）（±s）］

指標年齡≥40 歲<40 歲性別輕度肝臟炎癥（n=69）顯著肝臟炎癥（n=57）χ2/t 值P 值31（44.93）38（55.07）27（47.37）30（52.63）0.075 0.784男女39（56.52）30（43.48）34（59.65）23（40.35）0.125 0.723肝功能指標AST（U/L）ALT（U/L）TBil（μmol/L）PT（s）Alb（g/L）HBV?DNA（×103拷貝/mL）Galectin?9（ng/mL）PD?L1（%）32.86±7.09 32.07±8.51 16.55±4.19 12.69±1.29 40.83±3.96 7.75±1.07 1.65±0.47 1.39±0.28 33.85±8.13 33.19±7.62 17.41±4.58 13.02±1.25 40.34±4.07 8.90±1.24 2.24±0.62 1.68±0.37 0.730 0.771 1.099 1.449 0.683 5.588 6.072 5.004 0.467 0.442 0.274 0.150 0.496<0.001<0.001<0.001

表4 CHB 患者顯著肝臟炎癥多因素Logistic 回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of significant liver inflammation in CHB patients

2.4 血清Galectin?9、PD?L1 對CHB 患者肝臟炎癥程度的診斷價值

以顯著肝臟炎癥患者血清Galectin?9、PD?L1 水平為陽性樣本，以輕度肝臟炎癥患者血清Galectin?9、PD?L1 水平為陰性樣本，繪制各指標診斷肝臟炎癥程度的ROC 曲線，結(jié)果顯示，Galectin?9、PD?L1 估于 單?診斷聯(lián)合診斷AUC 最大，為0.850。見表5、圖1。

圖1 血清Galectin?9、PD?L1診斷肝臟炎癥程度的ROC曲線Figure 1 ROC curve of serum Galectin?9 and PD?L1 in the diagnosis of liver inflammation

表5 血清Galectin?9、PD?L1 對肝臟炎癥程度的診斷價值Table 5 The diagnostic value of serum Galectin?9 and PD?L1 on the degree of liver inflammation

3 討論

CHB 具有發(fā)病率高、傳染性強、難治愈等特點，病理改變主要為肝組織炎癥壞死，活動性慢性炎癥是導(dǎo)致CHB 肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌的重要因素［10］。因此，早期評價顯著肝臟炎癥，及時采取個體化治療，對抑制CHB 疾病進展，改善患者預(yù)后具有重要價值。但目前，臨床仍缺乏可快速、有效評價肝臟炎癥進展程度的手段，成為亟待解決的難題。

Galectin?9 屬半乳凝素家族成員，是Tim?3 配體，作為新型酸性粒細胞驅(qū)化物，具有誘導(dǎo)T 細胞凋亡、促進酸性粒細胞趨化等多種生物學(xué)功能，參與自身免疫性疾病、急性炎性反應(yīng)、過敏等的發(fā)生發(fā)展過程［11］。本研究顯示，CHB 患者血清Galectin?9呈異常高表達，且CHB 患者血清Galectin?9 水平與HBV?DNA、炎癥分級、纖維化分期均呈正相關(guān)，與相關(guān)研究［12］一致，提示Galectin?9 可能參與CHB 發(fā)生及病情進展。HBV 感染的慢性化與機體固有免疫及適應(yīng)性免疫損傷密切相關(guān)，尤其T 細胞功能耗竭［13］。耗竭的T 細胞毒性殺傷、分泌效應(yīng)因子及增殖能力降低，無法有效清除HBV，同時，過表達一些抑制性表面分子，如Tim?3、PD?L1 等，Tim?3 通過結(jié)合配體Galectin?9，誘導(dǎo)T 細胞功能耗竭［14］。多項研究表明，作為凝集素家族重要成員之一，Galectin?9 是病毒感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的免疫調(diào)控分子，發(fā)揮多種生物效應(yīng)，如調(diào)控細胞黏附、影響樹突狀細胞成熟及Treg 細胞分化、抗病原微生物等［15］。HBV 感染后，肝內(nèi)分泌大量干擾素（IFN）?β、IFN?γ，誘導(dǎo)Galectin?9 大量表達，與Tim?3結(jié)合后，使CD8+T 細胞增殖及分泌細胞因子的能力顯著降低，進而促進病情進展［16］。Logistic 回歸模型分析顯示，血清Galectin?9 水平升高均為CHB患者顯著肝臟炎癥獨立危險因素，進一步證實應(yīng)用Galectin?9 有助于監(jiān)測CHB 疾病進展。

CHB 免疫學(xué)機制一直是臨床研究重點，患者一旦出現(xiàn)特異性T 細胞功能減退，就無法清除病毒，引起HBV 慢性化［17］。多項研究表明，PD?1/PD?L1信號通路可降低T 細胞表面受體傳導(dǎo)的抗原信號，起到負性調(diào)節(jié)作用，可能在降低機體免疫清除HBV 能力方面起重要作用［18］。本研究結(jié)果也提示PD?L1 參與CHB 發(fā)生及發(fā)展。PD?L1 是PD?1 主要配體，屬B7 家族成員，可負向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，這點不同于其他B7 家族分子。生理狀況下，T 細胞、單核細胞、B 細胞PD?L1 表達處于較低水平，而HBV 感染后，淋巴細胞活化，PD?L1 表達增加（尤其T 細胞），腫瘤壞死因子?α（IFN?α）、粒細胞?巨噬細胞集落刺激因子（GM?CSF）、白介素?4（IL?4）等多種因子均可引起淋巴細胞表達PD?L1 增加［19］。另外，相較于PD?1 表達，PD?Ll 更加廣泛，可在T 細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、B 細胞、肝細胞、多種間質(zhì)細胞等表面表達，在多種組織上調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［20］。另ROC 曲線顯示，血清Galectin?9、PD?L1 在肝臟炎癥程度的診斷方面均具有一定價值，且二者聯(lián)合診斷的AUC 達0.850，可為CHB 患者肝臟炎癥程度診斷提供更準確數(shù)據(jù)參考。Galectin?9、PD?L1 參與CHB 患者免疫調(diào)節(jié)的作用機制不同，二者聯(lián)合可更全面反映病變情況，從而為顯著肝臟炎癥評價提供更全面信息。

綜上可知，CHB 患者血清Galectin?9、PD?L1 異常高表達，且可較準確地診斷肝臟炎癥程度，利于監(jiān)測CHB 疾病進展。但調(diào)節(jié)Galectin?9、PD?L1 相關(guān)通路可否改善CHB 患者免疫狀態(tài)，達到抑制病情進展的目的，尚待進一步研究。