PCT、Th17和Tregs在ACLF中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

倪艷 程玲 蔣玉鳳

慢加急性肝衰竭（Chronic and acute liver failure，ACLF）是發(fā)生在慢性肝病基礎(chǔ)上的一種短期內(nèi)出現(xiàn)急性或者亞急性的肝功能代謝失常的臨床癥侯群［1］。ACLF 患者可表現(xiàn)出黃疸、消化道癥狀（嘔吐、惡心、腹脹等）、肝性腦病或者伴有嚴(yán)重的凝血功能障礙等情況，預(yù)后較差。降鈣素原（Procalcito?nin，PCT）為臨床檢測機(jī)體內(nèi)毒素感染有效指標(biāo)，在臨床中可用于評估肝衰竭患者體內(nèi)毒素水平［2］。T輔助細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）是CD4+T 細(xì)胞亞群，以往研究發(fā)現(xiàn)，Th17與慢性肝炎的發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系［3］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Regulatory T cells，Tregs）是CD4+T 淋巴細(xì)胞的另一個(gè)亞群，有研究顯示，在肝臟或者血液中Tregs 的表達(dá)失衡是引起機(jī)體持續(xù)感染乙肝病毒以及疾病進(jìn)展的重要原因之一［4］。本研究將分析PCT、Th17、Tregs 在ACLF 中的變化趨勢，分析三者與ACLF 患者預(yù)后之間的聯(lián)系，以期為臨床診療ACLF以及改善預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2020年2月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的106 例ACLF 患者（ACLF 組），其中男77 例，女29 例，平均年齡（49.28±5.33）歲，根據(jù)病情嚴(yán)重程度分為［5］：早期41 例，中期39 例，晚期26 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《肝衰竭診療指南》中有關(guān)ACLF 的診斷級分期標(biāo)準(zhǔn)［5］；②臨床資料完整；③血清相關(guān)免疫學(xué)檢測證實(shí)HBsA g 陽性6 個(gè)月以上、HBsA b 陰性、HBeA g 陽性或陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤；②入院前有進(jìn)行藥物治療者；③藥物所致肝衰竭者；④合并酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病者；⑤合并代謝性疾病者。另選取本院同期97 例健康體檢志愿者（對照組），以及同期進(jìn)行治療的99 例慢性乙型肝炎（CHB 組），對照組中男63 例，女34 例，平均年齡（48.95±5.27）歲；CHB 組中男65 例，女34 例，平均年齡（49.10±5.18）歲。入選者在一般資料上比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，受試者已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PCT、Th17、Tregs 水平檢測

ACLF 組患者在入院后次日清晨抽取空腹靜脈血液5 mL，CHB 組、體檢者則在受檢當(dāng)日清晨抽取空腹靜脈血液5 mL，使用枸櫞酸鈉或肝素抗凝，離心分離血清。使用mini?VIDAS 全自動(dòng)免疫熒光分析儀檢測PCT，試劑及儀器均由法國梅里埃公司提供。使用FACS LSRII 流式細(xì)胞儀通過flowcytomix技術(shù)檢測Th17、Tregs 水平，試劑盒及儀器均由美國R&D 公司提供。操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 預(yù)后情況評估

觀察組患者均進(jìn)行內(nèi)科、人工肝等綜合治療，對患者進(jìn)行為期3 個(gè)月隨訪，截止至2020年5月31日，病情穩(wěn)定為預(yù)后良好；出現(xiàn)死亡、復(fù)發(fā)則判定為預(yù)后不良。收集患者一般資料，包括：年齡、性別、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、C 反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、中性粒細(xì)胞百分比（Per?centage of neutrophils，NEU%）、甲胎蛋白（Alpha fe?toprotein，AFP）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate amino?transferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）、前白蛋白（Prealbumin，PAlb）等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用方差檢驗(yàn)。采用多元Logistic回歸分析影響ACLF 患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析PCT、Th17、Tregs 對ACLF 患者預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值，并計(jì)算曲線下面積（AUC）。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組PCT、Th17、Tregs 表達(dá)水平比較

PCT、Th17、Treg 表達(dá)水平：ACLF 組>CHB 組>對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 三組PCT、Th17、Tregs 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of the expression levels of PCT，Th17 and Tregs in the three groups（±s）

表1 三組PCT、Th17、Tregs 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of the expression levels of PCT，Th17 and Tregs in the three groups（±s）

注：與對照組比較aP<0.05，與CHB 組比較bP<0.05。

組別對照組CHB 組ACLF 組F 值P 值n 97 99 106 PCT（ng/mL）0.49±0.12 4.11±1.24a 6.33±2.17ab 404.47<0.001 Th17（%）0.44±0.11 2.14±0.18a 3.60±0.71ab 720.79<0.001 Tregs（%）0.07±0.03 1.03±0.24a 2.92±0.85ab 787.81<0.001

2.2 不同時(shí)期ACLF 患者PCT、Th17、Tregs 表達(dá)水平比較

PCT、Th17、Tregs 表達(dá)水平：晚期>中期>早期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同時(shí)期ACLF 患者PCT、Th17、Tregs 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of the expression levels of PCT，Th17 and Tregs in ACLF patients in different periods（±s）

表2 不同時(shí)期ACLF 患者PCT、Th17、Tregs 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of the expression levels of PCT，Th17 and Tregs in ACLF patients in different periods（±s）

注：與早期組比較aP<0.05，與中期組比較bP<0.05。

組別早期中期晚期F 值P 值n 41 39 26 PCT（ng/mL）4.76±1.12 6.10±1.30a 9.15±1.37ab 98.38<0.001 Th17（%）2.20±0.11 3.11±0.18a 6.54±0.71ab 2270.11<0.001 Tregs（%）1.39±0.15 2.57±0.24a 5.87±0.85ab 796.24<0.001

2.3 影響ACLF 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

2.3.1 影響ACLF 患者預(yù)后不良單因素分析

不同性別、年齡、AST、ALB、PAlb 在預(yù)后良好組與預(yù)后不良組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），WBC、CRP、NEU、AFP、PCT、Th17、Tregs 指標(biāo)在兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 影響ACLF 患者預(yù)后不良單因素分析（±s）Table 3 Analysis of single factors affecting the prognosis of ACLF patients（±s）

表3 影響ACLF 患者預(yù)后不良單因素分析（±s）Table 3 Analysis of single factors affecting the prognosis of ACLF patients（±s）

因素性別（男/女）年齡（歲）WBC（×109/L）CRP（mg/L）NEU（%）AFP（mg/L）AST（U/L）ALB（g/L）PAlb（μmol/L）PCT（ng/mL）Th17（%）Tregs（%）預(yù)后良好組（n=75）58/17 49.14±5.12 6.32±2.16 9.20±3.84 61.32±15.24 2.15±0.16 23.26±3.21 36.71±3.54 4.62±1.33 4.61±0.18 2.36±0.75 1.70±0.06預(yù)后不良組（n=31）19/12 49.62±5.62 15.34±2.95 22.64±3.14 81.55±15.69 15.26±3.24 24.14±3.55 37.16±3.33 4.85±1.24 10.52±2.66 6.62±0.76 5.87±0.62 t/χ2值2.840 0.426 17.495 17.236 6.163 35.177 1.244 0.606 0.825 15.237 26.499 57.982 P 值0.091 0.670<0.001<0.001<0.001<0.001 0.216 0.546 0.410<0.001<0.001<0.001

2.3.2 影響ACLF 患者預(yù)后不良多因素分析

將單因素分析有差異的指標(biāo)進(jìn)行多元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：WBC、CRP、NEU、AFP、PCT、Th17、Tregs 為影響ACLF 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表4。

表4 影響ACLF 患者預(yù)后不良多因素分析Table 4 Analysis of multiple factors affecting the prognosis of ACLF patients

2.4 PCT、Th17、Tregs 對ACLF 患者預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值

依據(jù)ROC 曲線可知，PCT+Th17+Tregs 聯(lián)合預(yù)測NSCLC 預(yù)后不良敏感度和特異度分別為0.872、0.717，AUC=0.859，明顯高于三者單獨(dú)預(yù)測（P<0.05）。見表5、圖1。

表5 PCT、Th17、Tregs 對ACLF 患者預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值Table 5 The predictive value of PCT，Th17 and Tregs on the poor prognosis of ACLF patients

圖1 ROC 曲線圖Figure 1 The ROC curve

3 討論

PCT 在正常情況下表達(dá)水平低，但在機(jī)體出現(xiàn)細(xì)菌感染后、器官出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時(shí)可明顯上升，炎癥反應(yīng)所釋放出的PCT 也可被細(xì)菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素直接誘導(dǎo)［6］。以往研究發(fā)現(xiàn)ACLF 腸源性內(nèi)毒素血癥是重型肝炎發(fā)展為肝衰竭的重要誘因，在重型肝炎的進(jìn)展和預(yù)后方面有著重要的作用，因此預(yù)防和控制內(nèi)毒素血癥的發(fā)生是成功治療重型肝炎的關(guān)鍵［7］。在臨床中PCT 是檢測內(nèi)毒素的重要參考指標(biāo)，擁有較高的靈敏度，可為重癥感染性疾病診斷、病情進(jìn)展、預(yù)后等評估提供重要的參考信息［8］。本研究中，ACLF 患者PCT 水平明顯高于CHB 組與對照組，結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)推斷，PCT異常表達(dá)與ACLF 發(fā)生之間有一定關(guān)系。

ACLF 的進(jìn)展與機(jī)體天然免疫、適應(yīng)性免疫的紊亂有密切的聯(lián)系，樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）、T 淋巴細(xì)胞等均參與了ACLF 的疾病發(fā)生發(fā)展過程［9］。Th17、Tregs 作為CD4+T 細(xì)胞的亞群之一，兩者在免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要的作用。有研究顯示，Th17 參與了酒精性肝炎、慢性乙型肝炎、膽汁性肝硬化等多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，也參與宿主抵御細(xì)菌、病毒、真菌等機(jī)體免疫保護(hù)機(jī)制［10］。關(guān)于Th17 細(xì)胞對ACLF 患者臨床轉(zhuǎn)歸的影響目前并不清楚，但有數(shù)據(jù)顯示預(yù)后不佳的患者Th17 細(xì)胞比例及白細(xì)胞介素?17 水平明顯高于預(yù)后良好的患者，提示預(yù)后不佳的患者存在更加激烈的免疫病理損傷［11］。Tregs 可通過釋放抗炎因子發(fā)揮抗炎作用，多項(xiàng)研究證實(shí)Tregs 在維持自身免疫耐受及平衡中有著重要的作用［12］。Th17、Tregs 兩者在機(jī)體中的關(guān)系密切，兩者平衡失調(diào)可引起多種自身免疫性疾病［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，ACLF 患者中Th17、Tregs表達(dá)明顯高于對照組，與以往文獻(xiàn)研究結(jié)果相符［14］。提示Th17、Tregs 與ACLF 的病理過程密切相關(guān)，ACLF 患者Th17、Tregs 比例失衡，而Tregs 升高可能是為了阻止Th17 引起的過度免疫應(yīng)答而出現(xiàn)的負(fù)反饋性調(diào)節(jié)作用，以此控制疾病進(jìn)展。

本研究中，ACLF 早、中、晚期患者PCT、Th17、Tregs 表達(dá)存在差異，隨著患者病情進(jìn)展，三指標(biāo)呈明顯上升趨勢，說明ACLF 在不同時(shí)期的炎癥反應(yīng)及免疫狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化是不同的，ACLF 患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂的現(xiàn)象。PCT、Th17、Tregs 三者均為影響患者的預(yù)后相關(guān)因素，預(yù)后不良者Th17、Tregs、PCT水平明顯高于預(yù)后良好組，提示預(yù)后不佳者其免疫病理損傷及炎癥反應(yīng)更嚴(yán)重，機(jī)體免疫功能亢進(jìn)所引起的病理損傷以及炎癥反應(yīng)可能參與ACLF 疾病進(jìn)展過程。ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，PCT、Th17、Tregs 三者聯(lián)合檢測可有效提高ACLF 患者預(yù)后不良預(yù)測的敏感度、特異度，對患者早期診斷有積極意義。

綜上所述，PCT、Th17、Tregs 表達(dá)與ACLF 患者病情嚴(yán)重程度、預(yù)后存在密切聯(lián)系，病情嚴(yán)重、預(yù)后越差者其機(jī)體內(nèi)免疫紊亂、炎癥反應(yīng)更嚴(yán)重。監(jiān)測患者PCT、Th17、Tregs 水平變化，可為臨床治療及預(yù)后評估提供一定參考。