T2DM患者miR?377、VEGF及8?iso?PGF2α水平與腎損傷的相關性

范艷艷 呂莎莎 耿金平

目前我國糖尿病患者以2 型糖尿病（type 2 dia?betes mellitus，T2DM）為主，由微血管病變引發的糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是T2DM最嚴重并發癥之一，嚴重影響患者預后，因此，預測腎損傷發生對T2DM 患者有重要的臨床意義［1?2］。微小RNA（microRNA，miRNA）參與代謝和細胞凋亡等多個生物過程。既往研究表明，DN 患者體內異常表達的miRNAs 可能與其發生、發展和轉歸有所關聯，因此差異化表達的miRNAs 水平有望成為早期診斷糖尿病患者腎功能損傷的生物學指標，進一步推進臨床DN 治療［3］。血管內皮生長因子（vas?cular endothelial growth factor，VEGF）可以促進血管內皮細胞增殖，提高血管通透性，miRNA 通過調節VEGF 表達調控血管生成，影響疾病進展［4］。8?異前列腺素F2α（8?isoprostaglandin F2α，8?iso?PGF2α）是評價機體氧化應激反應的特征指標，尿β2?微球蛋白（β2?microglobulin，β2?MG）常被用作早期診斷腎損傷的特異性指標，胱抑素C（Cystatin C，Cys?C）是評價腎小球過濾功能的指標［5?6］。本研究將通過分析上述指標與T2DM 患者腎損害相關性及對腎損傷發生的預測價值，以期為臨床早期診斷T2DM 患者腎損傷提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1 到2020年10月廊坊市中醫醫院收治的200 例2 型糖尿病患者。納入標準：①根據中華醫學會糖尿病學分會制定的相關標準［7］確診為T2DM：有典型糖尿病癥狀，空腹血糖≥7.0 mmol/L或隨機血糖≥11.1 mmol/L；或無典型糖尿病癥狀，連續兩次空腹血糖≥7.0 mmol/L 或餐后2 h 血糖≥11.1 mmol/L 或連續兩次隨機血糖≥11.1 mmol/L。②年齡35～75 歲。排除標準：①有家族糖尿病史或患有1 型糖尿病；②其他基礎腎臟疾病；③合并嚴重感染后惡性腫瘤；④近期經歷大手術；⑤臨床資料不完整。根據糖尿病腎損傷相關診斷標準［8］，取24 h 尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）水平三次測量平均值，UAER=30～300 mg/24 h 定義為腎損傷，UAER≤30 mg/24 h 定義為腎未損傷，將患者分為腎損害組62 例（n=62）和非腎損害組138 例（n=138）。本研究經院醫學倫理委員會批準通過，受試者已簽署知情同意書。

1.2 觀察指標與檢測方法

記錄兩組研究對象年齡、性別、空腹血糖和病程等一般資料。

1.2.1 基礎指標

采集所有研究對象清晨空腹靜脈血及晨尿各5 mL，向血液樣本中加入肝素鈉抗凝，將血液和尿液樣本離心（3 500 r/min，r=10 cm，10 min），取上清液，采用免疫比濁法檢測血漿Cys?C、C 反應蛋白（C?reactive protein，CRP）水平和尿β2?MG 水平，采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosor?bent assay，ELISA）檢測血漿8?iso?PGF2α 和VEGF水平；采用脲酶電極法檢測血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）水平；采用苦味酸法檢測血肌酐（Serum Creatinine，Scr）水平。所有試劑盒均購自上海臻科生物科技有限公司。

1.2.2 血清miR?377 表達水平

采集所有患者清晨空腹靜脈血5 mL，離心（3 500 r/min，r=10 cm，10 min）取上清，加入Trizol提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒（北京泰澤嘉業科技發展有限公司）將RNA 逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，按PCR 擴增試劑盒（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）說明進行PCR 擴增，以GAPDH 為內參，實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real?time fluores?cence quantitative polymerase chain reaction，qRT?PCR）檢測血清miR?377 表達。miR?377 引物序列為：上游：5′?GTTTGTTTTAGGGTTATAGAAGTT?GG?3′，下游：5′?ATATAACCTTATTCAATCCAA CCTAC?3′；GAPDH 引物序 列為：上游：5′?GT?CAACGGATTTGGTCTGTATT?3′；下游：5′?AGT CTTCTGGGTGGCAGTGAT?3′。引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR 反應體系：反應總體積15 μL，94℃預變性4 min、94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共45 個循環。重復實驗3 次，取平均值，采用2?ΔΔCt法計算相對表達量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0 統計軟件進行數據分析，計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料采用（）表示，采用t檢驗；采用Pearson 分析血漿8?iso?PGF2α、VEGF 和血清miR?377 表達水平與T2DM患者腎損害的相關性；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血漿8?iso?PGF2α、VEGF 和血清miR?377 表達水平與T2DM 患者發生腎損害的預測價值。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料

兩組研究對象性別、年齡、BMI 和病程等一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），腎損傷組患者CRP、Scr、BUN、Cys?C 和β2?MG 水平均明顯高于非腎損傷組，白蛋白水平明顯低于非腎損傷組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 腎損傷組和非腎損傷組患者臨床資料［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between damage group and non?damage group［n（%），（±s）］

表1 腎損傷組和非腎損傷組患者臨床資料［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between damage group and non?damage group［n（%），（±s）］

類別性別t/χ2值P 值男女BMI（kg/m2）年齡（歲）病程（年）白蛋白（g/L）CRP（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）Cys?C（mg/L）β2?MG（mg/L）腎損傷組（n=62）32（51.61）30（48.39）23.16±2.01 56.78±8.67 8.28±2.12 23.86±7.44 10.38±3.31 348.58±48.63 16.91±3.66 2.17±0.67 0.19±0.08非腎損傷組（n=138）73（52.90）65（47.10）23.07±1.98 57.03±8.76 8.37±2.52 35.19±8.27 8.15±2.72 237.07±35.17 10.18±2.95 1.24±0.45 0.11±0.06 0.028 0.296 0.187 0.245 9.236 5.004 18.323 13.818 11.528 7.833 0.866 0.768 0.852 0.807<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2 兩組血漿VEGF、8?iso?PGF2α 及血清miR?377 表達水平比較

腎損傷組患者血漿VEGF、8?iso?PGF2α 及血清miR?377 表達水平均明顯高于非腎損傷組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組血漿VEGF、8?iso?PGF2α 及血清miR?377 表達水平比較（±s）Table 2 Comparison on the expression levels of plasma VEGF，8?iso?PGF2α and serum miR?377 between 2 groups（±s）

表2 兩組血漿VEGF、8?iso?PGF2α 及血清miR?377 表達水平比較（±s）Table 2 Comparison on the expression levels of plasma VEGF，8?iso?PGF2α and serum miR?377 between 2 groups（±s）

組別腎損傷組非腎損傷組t 值P 值n 62 138 VEGF（ng/mL）308.76±59.41 228.94±31.09 12.458<0.001 8?iso?PGF2α（ng/L）458.66±58.82 142.37±39.67 44.668<0.001 miR?377 1.42±0.18 0.97±0.12 20.841<0.001

2.3 血漿8?iso?PGF2α、VEGF 和血清miR?377 水平與T2DM 腎損害相關性分析

對T2DM 腎損害情況進行變量賦值，未發生腎損傷=0，發生腎損傷=1。Pearson 相關性分析顯示，血漿VEGF、8?iso?PGF2α 及血清miR?377 表達水平與T2DM 患者腎損傷程度呈正相關（r=0.313、0.332、0.341，P<0.05）。

2.4 血漿8?iso?PGF2α、VEGF、血清miR?377 水平對T2DM 患者發生腎損害的預測價值

選擇鑒別診斷腎損傷差異變量進行賦值，未發生腎損傷=0，發生腎損傷=1。血漿Cys?C、8?iso?PGF2α、尿β2?MG 聯合檢測鑒別診斷T2DM 腎損傷的AUC 為0.882（P<0.05）。見表3、圖1。

表3 ROC 分析血漿8?iso?PGF2α、VEGF、血清miR?377水平及聯合檢測T2DM 腎損傷Table 3 ROC curves of plasma 8?iso?PGF2α，VEGF，serum miR?377 and combined detection in the diagnosis of renal damage in T2DM

圖1 ROC 曲線圖Figure 1 ROC curve

3 討論

既往研究證明，Cys?C 參與調節細胞內蛋白質類化合物代謝，當腎小球濾過功能受損時，血中Cys?C水平迅速升高，隨病情加重逐漸增高，由于其在腎損傷早期即發生變化，適用于腎損傷的早期診斷［9］。β2?MG 能自由透過腎小球濾過膜，當腎小球濾過功能受損時，尿液β2?MG 含量明顯增加，是目前臨床反映腎小球濾過功能早期診斷的重要指標［10］。Scr和BUN 是臨床常用評價腎功能的指標，CRP 常用于炎癥反應的診斷與鑒別。當糖尿病進展為DN 后，患者上述指標均有明顯升高，提示臨床可以通過觀察這些指標的變化，對糖尿病患者發生腎功能損傷行初步預測。本研究結果，提示臨床可以通過觀察上述指標上來合理判斷腎臟病變的發生。

當血糖升高，增多的自由基催化生物膜上的花生四烯酸發生脂質過氧化產生8?iso?PGF2α，促使單核細胞粘附在微血管內皮細胞上，造成組織損傷，其水平一定程度上反映機體氧化應激反應水平［11］。有研究顯示，8?iso?PGF2α 水平在評估心血管疾病、糖尿病等方面具有重要價值，8?iso?PGF2α含量在糖尿病患者血液中和尿液中明顯升高，與本研究結果一致［12］。DN 作為糖尿病微血管并發癥，與VEGF 的表達密切相關。研究表明，VEGF 在DN 患者腎小球足細胞中持續表達，足細胞分泌的VEGF 與內皮細胞上的VEGF 受體結合，使血管通透性增加，改變腎小球濾過膜的通透性，加重腎功能損傷［13］。Wang 等［14］指出，高糖狀態下人系膜細胞中miR?377 表達明顯上調，并與DN 進展密切相關，其調控機制是通過增加纖連蛋白表達，造成腎小球細胞外基質沉淀。另有研究顯示，早期糖尿病患者尿液中出現miR?377 高表達，進一步說明miR?377 可能參與DN 的發生與發展［15］。miR?377 通過調控靶基因表達，調控相關信號通路，進而參與多種疾病進展。轉化生長因子TGF?β/SMAD 信號通路與DN 的發生與發展有密切關聯，SMAD 蛋白可誘導腎小球硬化和腎間質纖維化，是DN 發展的重要原因。miR?377 通過調控該信號通路，上調SMAD 蛋白表達，進一步加重T2DM 患者腎功能損傷，同時miRNA 在血液中保持穩定的優點使其成為DN 預測與評估的優質指標。本研究結果提示對三個指標進行及時檢測對T2DM 患者是否發生腎損傷及預測其損傷程度有一定應用價值。

Pearson 相關性分析顯示，血漿VEGF、8?iso?PGF2α 及血清miR?377 表達水平與T2DM 患者腎損傷程度呈正相關，即當上述指標表達水平升高時，患者腎損傷程度越高，且偏離正常水平越多標志患者腎損傷程度越高。血漿VEGF、8?iso?PGF2α、血清miR?377 表達水平及聯合檢測鑒別診斷T2DM 腎損傷的AUC 分別為0.781、0.767、0.770、0.882，說明三者在早期鑒別診斷T2DM 患者發生腎損傷方面有較高的檢測價值，當三者聯合檢測時，敏感度大大增加，提示臨床可以同時聯合三種指標檢測綜合判斷T2DM 發生腎損傷的可能性。

綜上所述，血漿VEGF、8?iso?PGF2α、血清miR?377 表達水平與腎損傷明顯相關，當腎臟發生器質性損傷時，三者水平均會明顯升高，能夠提示腎損傷程度，由于三者具有穩定、高效、敏感、特異性高等特點，有望成為臨床診斷T2DM 患者發生腎損傷的有效手段。