類泛素蛋白FAT10通過Nrf2/HO?1通路對心肌細胞缺血缺氧修復損傷的保護作用

陳天德 曹玉芳

缺血性心肌病是心血管疾病中最嚴重的一類，致死率較高［1］。缺血心肌組織恢復血供后發生再灌注損傷是缺血性心肌病發生的重要原因之一［2］。心肌再灌注損傷的發病機制目前尚未完全明確。有研究顯示，心肌缺血早期的心肌細胞損傷以凋亡為主，而晚期以壞死為主［2］。探討缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡的機制有重要意義。類泛素蛋白人類白細胞抗原F 介導轉錄因子10（Human HLA?F ad?jacent transcript 10，FAT10）在人類各種組織中廣泛表達，在靶蛋白降解、細胞周期調控、免疫調控等過程中發揮重要作用［3?5］。近年來研究顯示，FAT10 與細胞凋亡密切相關［3］。核因子E2 相關因子2（nu?clear factor erythroid2?related factor 2，Nrf2）是機體重要的抗氧化分子，可以靶向調控血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO?1），影響心肌細胞凋亡［6］，在心肌缺血再灌注損傷的發病過程中起到重要作用［7］。FAT10 與Nrf2/HO?1 通路的關系尚不清楚，本研究采用小干擾RNA（siRNA）沉默FAT10 蛋白，檢測心肌細胞凋亡情況，旨在探討FAT10 在心肌缺血再灌注損傷中的作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

H9C2 大鼠心肌細胞購于通派（上海）生物科技有限公司，胎牛血清、DMEM 培養基和胰蛋白酶購于上海臥宏生物科技有限公司，細胞活力檢測試劑盒（cell cuounting kit 8，CCK?8）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購于武漢卡諾斯科技有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodec?yl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS?PAGE）凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，siRNA 轉染試劑購于美國Sigma 公司，An?nexin V?FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司，FAT10 抗體、Nrf2 抗體、HO?1抗體、GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔抗體均購于美國bioxcell 公司，混合氣體購于上海恒遠生物科技有限公司，FAT10 沉默序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并提供，序列為：5′?GCCCTTACC?GTTCCAAGGCC?3′。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將H9C2 細胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗混合液的DMEM 培養基中，進行傳代培養，培養條件為5% CO2、37℃。待細胞生長至80%時，用胰蛋白酶消化進行傳代。

1.2.2 心肌細胞缺氧復氧模型的構建

將細胞（密度為2×105/孔）接種于6 孔板中，在5% CO2、37℃條件下培養48 h。將95%氮氣和5%CO2充入Concept 400M 厭氧培養箱，構建缺氧復氧模型。將細胞分為對照組、缺氧4 h 組、復氧2 h組及復氧4 h 組。對照組正常培養。缺氧前首先將DMEM 培養基更換為無糖無血清培養基，進行同步化處理3 h，隨后將缺氧組及復氧組細胞放入厭氧培養箱，沖入混合氣體，缺氧4 h 后取出。復氧組將培養基更換為DMEM 培養基，在5% CO2、37℃條件下進行復氧處理2、4 h。

1.2.3 CCK?8 法檢測心肌細胞活力

將心肌細胞（密度為8×103/孔）接種于96 孔板，對照組正常培養，其余組缺氧復氧處理后，加入CCK?8 溶液，孵育1 h，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。使用BK?EL10C 酶標儀在450nm處檢測光密度值。實驗重復4 次。

1.2.4 微量酶標法檢測LDH

建立心肌細胞缺氧復氧模型后，取細胞上清液，使用LDH 試劑盒以微量酶標法檢測LDH，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。實驗重復4 次。

1.2.5 Annexin V?FITC/PI 法檢測心肌細胞凋亡

將細胞制成1×106個/mL 的懸液，加入5 μL 異硫氰酸熒光素，孵育10 min，隨后加入2.5 μL 碘化丙啶，孵育5 min。最后使用美國Orflo 流式細胞儀檢測凋亡率。實驗重復4 次。

1.2.6 細胞轉染

將心肌細胞（密度為2×105/孔）加入6 孔板，用120 μL riboFECT CP Buffer（v2）轉染試劑稀釋10 μL 的siRNA 儲備液，隨后加入12 μL ribo?FECT CP Buffer（v4），溫室孵育10 min。隨后將混合物加入1 858 μL 的DMEM 培養基中。用脂質體轉染法將陰性對照RNA 序列（si?CON）和FAT10 沉默序列轉入心肌細胞。將心肌細胞分為對照組、缺氧4 h+si?CON 組（陰性對照）、缺氧4 h+siRNA 組、復氧4 h+si?CON 組（陰性對照）、復氧4 h+siRNA 組。

1.2.7 Western?blot 檢測心肌細胞FAT10、Nrf2、HO?1 蛋白表達水平

用RAPI 裂解液提取心肌細胞中的總蛋白，用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，10% SDS?PAGE 電泳分離蛋白，用半干轉移法將蛋白轉至PVDF 膜上。隨后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入FAT10 抗體（稀釋500 倍）、Nrf2 抗體（稀釋1 000 倍）、HO?1 抗體（稀釋1 000 倍），4℃過夜孵育，次日除去一抗，用TBST 緩沖液洗滌3 次后加入二抗。用ECL 發光儀成像，Image J 軟件分析灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計處理。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較用LSD?t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧復氧模型的建立

細胞活性檢測結果顯示，隨時間延長，心肌細胞存活率下降，在復氧4 h 后最低。復氧4 h 組細胞存活率低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。LDH 檢測結果顯示，隨時間延長，心肌細胞損傷加重，在復氧4 h 后最嚴重。復氧4 h 組LDH 活性高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。流式細胞術檢測結果顯示，在復氧4 h 后心肌細胞凋亡率最高。復氧4 h 組細胞凋亡率高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

表1 各組細胞存活率、LDH 活性和細胞凋亡率比較（±s）Table 1 Comparison of cell survival rate，LDH activity and apoptosis rate in each group（±s）

表1 各組細胞存活率、LDH 活性和細胞凋亡率比較（±s）Table 1 Comparison of cell survival rate，LDH activity and apoptosis rate in each group（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05。

組別對照組缺氧4 h 組復氧2 h 組復氧4 h 組n 4 4 4 4細胞存活率（%）1 65.12±10.12a 62.7±15.20a 54.70±8.24a LDH 活性（U/L）87.23±6.27 110.26±14.29a 200.34±35.05a 271.46±60.02a細胞凋亡率（%）4.08±0.87 8.21±1.02a 14.65±3.41a 19.33±3.17a

圖1 流失細胞術檢測的代表性圖片Figure 1 Representative images of drain cytometry assays

2.2 缺氧復氧對FAT10 蛋白表達的影響

FAT10 蛋白表達水平：復氧4 h+si?CON 組>缺氧4 h+si?CON 組>對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2、圖2。

表2 各組FAT10 蛋白相對表達量及細胞凋亡率比較（±s）Table 2 Comparison of the relative expression of FAT10 protein and cell apoptosis rate in each group（±s）

表2 各組FAT10 蛋白相對表達量及細胞凋亡率比較（±s）Table 2 Comparison of the relative expression of FAT10 protein and cell apoptosis rate in each group（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與缺氧4h+si?CON 組比較，bP<0.05；與對應的陰性對照組比較，c P<0.05。

組別對照組缺氧4h+si?CON 組缺氧4h+siRNA 組復氧4h+si?CON 組復氧4h+siRNA 組n4 4 4 4 4蛋白相對表達量1 1.67±0.23a 1.12±0.20c 2.02±0.31ab 1.03±0.17c細胞凋亡率（%）3.67±1.50 7.43±2.03 14.04±3.15c 12.00±2.32 16.46±1.29c

圖2 Western?blot 檢測的代表性條帶Figure 2 Representative bands detected by Western?blot

2.3 沉默FAT10 表達對心肌細胞凋亡的影響

FAT10 蛋白表達水平：復氧4 h+siRNA 組<缺氧4 h+siRNA 組<缺氧4 h+si?CON 組，見表2、圖2。沉默FAT10 后細胞凋亡率升高（P<0.05）。見表2、圖3。

圖3 流失細胞術檢測的代表性圖片Figure 3 Representative images of drain cytometry assays

2.4 沉默FAT10 表達對Nrf2、HO?1 蛋白表達水平的影響

缺氧復氧損傷使FAT10 蛋白表達水平增加，Nrf2、HO?1 蛋白表達水平也增高。沉默FAT10后，Nrf2、HO?1 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見表3和圖4。

表3 各組FAT10、Nrf2、HO?1 蛋白表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of protein expression levels of FAT10，Nrf2 and HO?1 in each group（±s）

表3 各組FAT10、Nrf2、HO?1 蛋白表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of protein expression levels of FAT10，Nrf2 and HO?1 in each group（±s）

注：與復氧4h+si?CON 組比較，aP<0.05。

組別對照組復氧4h+si?CON 組復氧4h+si?RNA 組n4 4 4 FAT10 1 1.95±0.21 1.62±0.10a Nrf2 1 1.45±0.12 1.21±0.09a HO?1 1 1.51±0.10 1.18±0.11a

圖4 Western?blot 檢測的代表性條帶Figure 4 Representative bands detected by Western?blot

3 討論

心肌缺血再灌注損傷會造成一系列并發癥，如心律失常、心衰等，對疾病預后造成不良影響［8］。心肌缺血再灌注損傷的發病機制目前尚未完全明確，可能與氧化應激損傷、鈣離子超載、能量代謝障礙、免疫炎癥損傷等有關［9?10］。心肌缺血再灌注損傷過程中存在心肌細胞凋亡現象，如何減少心肌細胞凋亡已成為疾病研究熱點［11?12］。FAT10 是泛素樣蛋白家族成員之一，由165 個氨基酸組成，其基因位于6 號染色體上。既往FAT10在腫瘤疾病中被研究的較多，FAT10 與細胞增殖、細胞周期、凋亡和免疫反應密切相關［13］。研究發現，FAT10 可以通過穩定caveolin?3 緩解缺氧誘導的心肌細胞凋亡［14］。另外，FAT10 可以抑制沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）改善心肌細胞自噬，進而對缺血心肌組織起到保護作用［15］。

FAT10 與心肌缺血再灌注損傷的關系，既往未見報道。本研究將95%氮氣和5% CO2充入Concept 400M 厭氧培養箱，構建缺氧復氧模型。細胞活性檢測結果顯示，隨時間延長，心肌細胞存活率下降，在復氧4 h 后最低。復氧4 h 組細胞存活率低于對照組。LDH 檢測結果顯示，隨時間延長，心肌細胞損傷加重，在復氧4 h 后最嚴重。復氧4 h 組LDH 活性高于對照組。流式細胞術檢測結果顯示，在復氧4 h 后心肌細胞凋亡率最高。復氧4 h 組細胞凋亡率高于對照組。結合上述結果，本研究選擇缺氧4 h、復氧4 h 為模型建立的時間進行后續研究。缺氧4h、復氧4h 為模型建立的最佳時間，與既往報道一致［16］。在心肌細胞缺氧復氧過程中，心肌細胞FAT10 表達水平升高。

本研究中，缺氧4 h+si?CON 組FAT10 蛋白相對表達水平高于對照組，復氧4 h+si?CON 組FAT10 蛋白相對表達水平高于對照組，復氧4 h+si?CON 組FAT10 蛋白相對表達水平高于缺氧4 h+si?CON 組，提示FAT10 參與了缺氧復氧損傷過程，可能是保護心肌細胞損傷的因子。此外，沉默FAT10 后細胞凋亡率升高，說明FAT10 激活與心肌細胞凋亡有關，可能起到保護作用。Nrf2 是抗氧化應激損傷的重要分子，受到刺激后，Nrf2 進入細胞核，與氧化應答元件結合后被激活，進而靶向作用于HO?1，發揮抗氧化作用［17］。既往研究顯示，Nrf2/HO?1 通路與心肌細胞凋亡有關［17］。本研究發現，沉默FAT10 基因后Nrf2 和HO?1 蛋白表達水平降低，提示FAT10 可能通過激活Nrf2/HO?1通路對心肌細胞缺氧復氧損傷起到保護作用。

綜上所述，FAT10 可能通過Nrf2/HO?1 通路抗心肌細胞凋亡，進而對缺氧修復損傷起到保護作用，FAT10 可能成為缺血再灌注損傷的潛在靶點。然而本研究僅分析了FAT10 對心肌細胞存活及凋亡的影響，未分析心肌細胞免疫炎癥損傷、氧化應激損傷等的變化，而這些變化與缺血再灌注損傷密切相關。未來需要開展細胞和動物研究，進一步明確FAT10 在缺血再灌注中的作用及機制。