伴H3K27M突變的脊髓彌漫性中線膠質瘤的臨床病理特征和預后

吳小延 黃超蕓 羅威 王芳 杜紫明 鄧玲★

根據2016年世界衛生組織（World Health Or?ganization，WHO）分類，在H3F3A或HISTIH3B/C中具有H3K27M突變的彌漫性中線膠質瘤被認為是一種新的實體，稱為“彌漫性中線膠質瘤，H3K27M突變體”［1］。它主要發生在丘腦、腦干和脊髓等中線結構。以往文獻報道了彌漫性中線膠質瘤，H3K27M突變體在大腦的中線結構中，包括成人的丘腦和腦干；鮮有報道脊髓彌漫中線膠質瘤H3K27M突 變病例［2?3］。因此，迫切 需要根據2016年WHO 分類從患者中總結脊髓彌漫中線膠質瘤H3K27M突變體的特征和預后因素。本研究分析2017年至2021年在中山大學附屬腫瘤醫院確診的13 例脊髓彌漫中線膠質瘤患者的臨床、分子病理特征和預后因素。以更全面地了解脊髓彌漫中線膠質瘤，并為其管理提供詢證實踐。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

評估2017年11月至2021年9月期間在中山大學附屬腫瘤醫院手術且經病理確診為脊髓彌漫中線膠質瘤的13 名患者的臨床結果見表1。患者平均年齡為（27.5±14.4）歲，76.9%（10/13）的患者為成人（≥18 歲）。平均隨訪時間為15.3 個月（1.7～34個月），其中男性10 例，女性3 例，男性占優勢。腫瘤的發生頻率依次為胸椎（30.8%），胸腰椎（30.8%），腰椎（15.4%），頸椎（15.4%），頸胸椎（7.7%）。納入標準：①所有患者均根據2016年WHO 分類明確組織病理學診斷為脊髓彌漫中線膠質瘤；②H3K27M均為突變狀態；③可獲得患者的隨訪信息。排除標準：①脊髓以外部位的膠質瘤患者；②H3K27M野生狀態；③術后失訪的患者。本研究經院醫學倫理委員會批準，且獲得所有患者知情同意。

表1 13 例脊髓彌漫中線膠質瘤患者的病理特征Table 1 Pathological characteristics of 13 patients with diffuse midline glioma of the spinal cord

1.2 方法

組織病理學分級是通過蘇木精和伊紅（H&E）染色對福爾馬林固定/石蠟包埋（Formalin fixation/paraffin embedding，FFPE）樣本進行常規評估來確定的。所有切片均由至少兩名經驗豐富的病理學家進行審查。免疫組織化學染色采用Envision 法，單克隆抗體選用膠質纖維酸性蛋白（Glial fibril?lary acidic protein，GFAP）購自北京中杉金橋生物技術有限公司（0.2 mL/支，21030609）、Olig?2購自福州邁新生物技術開發有限公司（0.2 mL/支，2106240681C3）、ATRX購自福州邁新生物技術開發有限公司（0.2 mL/瓶，2107290855C2）、P53購自蘇州百道醫療科技有限公司（0.2 mL/瓶，PA21061A01）、H3K27M購自基因科技（上海）有限公司（0.2 mL/瓶，2021051401）、Ki?67購自丹麥Da?ko 公司（12 mL/瓶，41282723）。采用羅氏公司BenchMark XT 全自動免疫組織化學儀器染色。1p/19q共缺失通過熒光原位雜交（fluorescence in si?tu hybridization，FISH）技術進行檢測，FISH探針購自廣州安必平醫藥科技股份有限公司，包括1q21/L 1p36和19p13/19q13 兩組探針（5 人份/盒，202112001），采用Olympus BX51 熒光顯微鏡觀察結果。

1.3 基因突變分析

采用FFPE 樣本DNA 分離提取試劑盒（基因科技股份有限公司，50 次測試/盒，批號：2021111801）提取組織DNA，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作。對抽提后的DNA 進行PCR 擴增后，通過Sanger 測序檢測H3F3A/HIST1H3B K27M、IDH1R132H 以及TERT啟動子C228T 和C250T 突變；其中TERT采用巢式PCR 的方法進行擴增，使用的引物序列見表2。按25 μL PCR 體系進行擴增。H3F3APCR 反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環10次；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30 次；72℃延伸5 min，12℃保溫。IDH1PCR 反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環32 次；72℃延伸5 min，12℃保溫。TERTPCR 反應程序為：94℃預變性5 min，98℃變性10 s，75 ℃退火1 min，循環30 次；98℃變性10 s，58℃退 火15 s，68℃延 伸1 min，循環35 次；72℃延伸5 min，12℃保溫。擴增后的PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。Sanger 測序利用測序試劑盒中bigdye mix，利用設計好的測序引物，于ABI 3500XL 型測序儀進行測序。

表2 H3/IDH1 基因引物序列Table 2 H3/IDH1 gene primers sequence

1.4 隨訪方法

通過電話聯系脊髓彌漫中線膠質瘤患者并詢問患者的狀態，采用中山大學腫瘤防治中心病案管理系統，通過查閱病歷對患者進行了隨訪，隨訪內容包括性別、年齡、組織學分級及腫瘤部位。生存時間定義為從手術日期到最后一次隨訪或死亡日期。

1.5 統計學方法

采用統計軟件R 語言對數據進行統計分析；預后因素和生存情況采用Kaplan?Meier 和log?rank檢驗以及單變量Cox 回歸對結果進行比較分析；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分子病理特征

免疫組織化學染色顯示，13 例病變中，所有腫瘤細胞呈H3K27M核陽性表達（以血管內皮細胞為陰性內對照），陽性率為100%（100/100），見圖1。基因檢測結果顯示，13 例患者出現基因突變，與免疫組織化學陽性病例完全吻合，突變基因均為H3F3ANM_002107.4：c.80A>T（p.K27M），見圖2。其他分子特征示瘤細胞不同程度的表達，11 例患者進行了P53檢測，強陽性表達者9 例（81.8%）；10 例進行ATRX檢測，結果顯示8 例ATRX表達缺失（80.0%）；13 例患者進行GFAP及Olig?2檢測，結果顯示兩個均有不同程度陽性；10 例進行1P/19Q共缺失檢測，結果顯示10 例（100%）1P/19Q均陰性；Ki?67陽性指數為1%～40%。10 例患者IDH1基因檢測均陰性；8 例患者TERT啟動子基因檢測均陰性。見表3。

圖1 脊髓彌漫中線膠質瘤病理特征Figure 1 Pathological characteristics of diffuse midline glioma of the spinal cord

圖2 H3K27M基因點突變NM_002107.4：c.80A>T（p.K27M）Figure 2 H3K27M gene point mutation NM_002107.4：c.80A>T（p.K27M）

表3 13 例脊髓彌漫性中線膠質瘤的分子特征Table 3 Molecular characteristics of 13 cases of diffuse midline glioma of the spinal cord

2.2 生存分析

在本研究中，有3 名患者表現出腫瘤擴散。13 例患者的生存率為69.2%，中位生存時間為13.0 個月（1.7～34 個月），隨訪期間4 例患者死亡。13 例脊髓彌漫中線膠質瘤患者的1、2年生存率分別為61.5%、15.4%，見圖4A。組織學分級Ⅰ/Ⅲ和Ⅳ級腫瘤患者的中位總生存時間比較，兩者差異無統計學意義（P>0.05）（圖4B）。排除頸脊髓彌漫中線膠質瘤患者后，中位總生存時間為15.3 個月，而在包括所有脊髓膠質瘤患者后，中位生存時間為13.0 個月，兩者差異有統計學意義（P<0.05）（圖4C）。此外，7 名患者（53.8%）接受了替莫唑胺治療，而接受替莫唑胺治療的患者較未接受替莫唑胺治療的患者平均生存時間長4.5 個月；差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4D。

圖4 13 例脊髓彌漫中線膠質瘤患者的生存曲線Figure 4 Survival curves of 13 patients with diffuse midline glioma of the spinal cord

2.3 COX 單因素分析

當年齡、性別、腫瘤位置、WHO 分級和替莫唑胺治療被納入Cox 模型時，排除頸髓病變患者的因素與脊髓彌漫中線膠質瘤的預后之間的差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 脊髓彌漫中線膠質瘤的單因素相關分析Table 3 Single factor correlation analysis of diffuse midline glioma of the spinal cord

3 討論

由于脊髓膠質瘤的罕見性，其治療仍存在爭議，也沒有建立專門的治療指南［1］。本研究根據病理分級比較了中位總生存時間WHOⅠ/Ⅲ級和WHOⅣ級腫瘤患者，盡管兩種級別的腫瘤患者的生存率差異無統計學意義，但WHOⅠ/Ⅲ級膠質瘤患者的生存期更好，中位總生存時間為15.2 個月，而WHOⅣ級膠質瘤患者的中位總生存時間為13.0 個月。本研究結果與之前的研究，替莫唑胺可降低脊髓膠質瘤患者術后復發率和死亡率結果一致［4］。此外，本研究通過排除或包括頸髓病變的患者來比較生存率，兩者差異有統計學意義。同樣，Toshitaka Se?ki1［5］等人報道，排除頸髓病變患者與包括頸髓病變的所有患者預后差異有統計學意義，Nakamura［6］等人報道，頸髓腫瘤患者的預后明顯低于胸脊髓腫瘤患者。以上研究提示頸髓病變因素與脊髓彌漫中線膠質瘤預后存在相關性。

分子研究的最新進展顯示，包括IDH1突變、1p/19q共缺失、H3K27M突變、TERT啟動子突變等基因，徹底改變了診斷膠質瘤的分類和精準化治療［2］。然而，與腦膠質瘤相比，以往關于脊髓膠質瘤的研究單篇報道比較罕見，脊髓膠質瘤的分子特征仍然很大程度上未知［5，7?8］。本研究13 例脊髓彌漫中線膠質瘤的分子研究顯示，IDH1突變率0%（0/10），ATRX和P53分別為80.0%（8/10）和81.8%（9/11）。與之前的文獻相符合［9?11］。有研究提示TERT啟動子突變與IDH1野生型脊髓膠質瘤的存活率低有關［12］。本研究發現8 例TERT啟動子全部無突變。另外，本研究也揭示分子譜的同質性，例如所有IDH1及TERT陰性，無1p/19q共缺失。

此外，本研究注意到H3K27M突變型脊髓彌漫中線膠質瘤的中位年齡為31 歲（11～56 歲），H3K27M突變型脊髓彌漫中線膠質瘤的中位總生存時間為13 個月，這與之前的報道一致，但與腦干星形細胞瘤有顯著差異，腦干細胞瘤主要發生在青少年中，中位總生存時間小于12 個月［13］。以上結論說明控制發育的遺傳因素在腦干和脊髓星形細胞瘤存在差異，并可能為治療策略提供特定位置的分子靶點。

綜上，雖然H3K27M突變被認為是彌漫性中線膠質瘤的有力標志物，但研究證明在評估H3K27M突變脊髓星形細胞瘤的預后時不能忽視頸髓病變患者。本研究結果為改善脊髓彌漫中線膠質瘤的管理提供了基于證據的信息。本研究的局限性包括其回顧性設計，并且由于樣本數量小，缺乏可用樣本進行充分分析，這可能會引入選擇偏差。未來有必要通過大規模數據分析來證實脊髓彌漫中線膠質瘤的特異性，并為髓彌漫中線膠質瘤的臨床治療尋找新的分子標志物。