miR?194?5p與分化型甲狀腺癌術后轉移相關性的探討

黃月 付青 張茜 許海洋

甲狀腺癌根據組織分化可分為分化型與未分化型兩種，其中分化型甲狀腺癌占全部甲狀腺癌的75%，而分化型又包括乳頭狀甲狀腺癌和濾泡狀甲狀腺癌兩種［1］。乳頭狀甲狀腺癌生長緩慢，惡性度亦較低，早期可伴有頸部淋巴結轉移，多數患者能獲得良好預后；而濾泡狀甲狀腺癌惡性度高于乳頭狀甲狀腺癌，腫塊生長快［2］。Zhao 等［3］結果表明：甲狀腺癌好發于兒童及中老年人群中，且女性發病率略高于男性，臨床多表現為單一甲狀腺結節、質地堅硬，超聲下可見結節直徑>1 cm、實體性，能與外周組織區分。手術治療是分化型甲狀腺癌常用的干預方法，借助手術能切除病灶組織，且多數患者可從中獲益［4］。但是，仍有1.2%～4.2%患者進展為遠處轉移，5年生存率僅為36%［5］。外周血循環miRNAs 具有穩定性好、取材方便、檢測成本低等優勢，在檢驗醫學中具有巨大的潛力［6］。王芳等［7］研究報道：miR?194?5p 在甲狀腺癌組織中呈高表達，可通過調節腫瘤細胞促凋亡基因或凋亡抑制基因活性，參與腫瘤細胞的生物學過程。因此，本研究以北京天壇醫院收治分化型甲狀腺癌患者為對象，探討miR?194?5p 與分化型甲狀腺癌術后轉移相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2020年12月至2021年12月首都醫科大學附屬北京天壇醫院收治的分化型甲狀腺癌患者198 例為對象，根據術后是否發生轉移分為轉移組與非轉移組。轉移組46 例，男15 例，女31 例，平均年齡（58.91±6.36）歲；平均體重指數（Body mass index，BMI）（23.14±3.49）kg/m2；甲狀腺乳頭狀癌35 例，甲狀腺濾泡狀癌11 例。非轉移組152 例，男43 例，女109 例，平均年齡（58.99±6.42）歲；平均BMI（23.43±3.52）kg/m2；甲狀腺乳頭狀癌114 例，甲狀腺濾泡狀癌38 例。本研究獲得倫理委員會批準，患者或家屬簽署同意書，兩組臨床資料比較差異無統計意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入、排除標準

納入標準：①符合分化型甲狀腺癌診斷標準［8］，均經病理檢查確診；②均采用雙側甲狀腺全切術治療，且患者均可耐受；③術后擬行131I 治療，且均未接受放化療、生物免疫治療與內分泌治療。排除標準：①精神異常、嚴重肝腎功能不全或急慢性感染者；②內分泌系統與血液系統相關疾病、認知功能異常者；③既往合并其他惡性腫瘤史者或冠心病、心衰史者。

1.3 方法

1.3.1 術后轉移判斷

131I 治療6 個月后對患者常規行131I 全身顯像檢查，檢查儀器為SPECT/CT Discovery 670，購自于GE 公司。根據患者情況設定測定參數：步徑速度9.2～10 cm/min，矩陣為256×1024，常規完成頸、胸部斷層顯像，6°/幀，合計采集60 幀，矩陣為64×64［9］。

1.3.2 標本采集

術前采集空腹外周肘靜脈血5 mL，置于肝素鈉抗凝管中，10 min 離心，速度8 000 rpm，離心半徑8 cm。待上述操作完畢后，將標本轉移到RNase?free 離心管中，10 min 離心，速度8 000 rpm，離心半徑8 cm，去除細胞碎片與雜志，備用。

1.3.3 miR?194?5p 測定

采用實時熒光PCR 法測定各組miR?194?5p mRNA 水平，取上述分離的血清標本，采用Trizol法常規處理血液標本，完成總RNA 提取，采用紫外分光光度儀測定所提取的RNA 純度，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定總RNA 純度。采用PCR 試劑盒完成cRNA。待上述操作完畢后，完成逆轉錄：RNA 模板14 μL、2 μL Enzymemix，4 μL×RT緩沖液補充到20 μL，在PCR 檢測儀上42℃1 h、95℃5 min，將合成的cDNA 放置在-20℃冰箱中，保存。設定反應體系：cDNA 模板8 μL、SYBRP Green mix 10 μL、PCR Primer mix 2 μL。引物設計如下：上游引物序列：5′?AGUGAAUUCUAC?CAGUGCCAUA?3′；下游引物序列：5′?CAGUA?CUUUUGUGUAGUACAA?3′；設定反應條件：95℃下預變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃下延伸30 s，上述操作均連續完成45 個循環，每個血液標本重復3 次，取CT 值。以β?actin作為內參，采用2?ΔΔCt完成不同血液標本中miR?194?5p mRNA 表達量［10］。

1.3.4 甲狀腺水平測定及相關性分析

取上述分離的血清標本，采用電化學發光法測定患者促甲狀腺激素（Thyroid stimulating hor?mone，TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（Free triiodo?thyronine，FT3）、游離甲狀腺素（Serum free thyrox?ine，FT4）、甲狀腺球蛋白（Thyroglobulin，Tg）及甲狀腺球蛋白抗體（Thyroglobulin antibody，TgAb）水平，儀器為Roche cobas6000 電化學發光儀，購自于Roche 公司，所有操作嚴格遵循儀器與試劑盒說明書完成［11］。采用Pearson 相關性分析軟件對分化型甲狀腺癌患者miR?194?5p 與甲狀腺相關激素完成相關性分析。

1.4 統計分析

采用SPSS 24.0 統計軟件進行統計處理，計量資料采用（）表示，行t檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miR?194?5p 及甲狀腺功能比較

轉移組與非轉移組TSH、FT3、FT4 水平比較差異無統計意義（P>0.05）；轉移組miR?194?5p、Tg及TgAb 水平高于非轉移組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組miR?194?5p 及甲狀腺功能比較（±s）Table 1 Comparison of miR?194?5p and thyroid function between the 2 groups（±s）

表1 兩組miR?194?5p 及甲狀腺功能比較（±s）Table 1 Comparison of miR?194?5p and thyroid function between the 2 groups（±s）

組別轉移組非轉移組t 值P 值n 46 152 miR?194?5p 2.41±0.38 1.02±0.24 6.015 0.000 TSH（mIU/L）79.78±6.35 80.11±6.36 0.191 0.846 FT3（pg/mL）3.20±0.63 3.18±0.61 1.217 0.539 FT4（pg/mL）10.32±0.79 10.34±0.83 0.996 0.693 Tg（ng/mL）48.69±5.29 5.72±0.67 74.395 0.000 TgAb（IU/mL）17.68±2.14 14.35±1.95 7.302 0.000

2.2 miR?194?5p、Tg 聯合TgAb 在分化型甲狀腺癌術后轉移診斷效能

ROC 曲線結果表明：miR?194?5p、Tg 聯合TgAb 在分化型甲狀腺癌術后轉移中診斷靈敏度與特異度高于單一檢測（P<0.05）。見表2、圖1。

表2 miR?194?5p、Tg 聯合TgAb 在分化型甲狀腺癌術后轉移診斷效能Table 2 The diagnostic efficacy of miR?194?5p，Tg combined with TgAb in differentiated thyroid cancer postoperative metastasis

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

2.3 分化型甲狀腺癌術后轉移miR?194?5p 與甲狀腺指標相關性

Pearson 相關性分析結果表明：分化型甲狀腺癌術后轉移miR?194?5p 與TSH、FT3、FT4 水平無相關性（P>0.05）；與Tg 及TgAb 水平呈正相關性（P<0.05）。見表3。

表3 分化型甲狀腺癌術后轉移miR?194?5p 與甲狀腺指標相關性Table 3 The correlation between miR?194?5p and thyroid indexes after the operation of differentiated thyroid cancer

3 討論

分化型甲狀腺癌惡性程度相對較低，且患者多以手術干預為主，借助手術能切除病灶組織，多數患者可從中獲益。但是，部分患者術后區域性淋巴結轉移發生率較高，成為影響患者手術預后及生存的重要原因之一［12］。Marina 等［13］研究表明：由于分化型甲狀腺癌患者病灶組織分化良好，能合成與分泌Tg、TgAb。通過測定Tg、TgAb 能反映患者術后恢復情況，亦可實現術后轉移監測。但是，Tg、TgAb 臨床使用時常可以相互影響，臨床上尚缺乏排除二者影響的方法。國外學者研究表明：Tg、TgAb 用于分化型甲狀腺癌患者難以動態反映患者的病情，導致臨床使用受到限制［14］。

微小RNA 是機體內源性表達的非編碼小分子單鏈RNA，缺乏閱讀框，難以編碼任何蛋白，但是具有高度的保守性、組織特異性及時序性。目前，臨床上已經鑒定出miRNA 合計8 000 多種，能調節真菌、植物、動物等發育［15］。Renaud 等［16］研究表明：miRNA 的保守性進化有助于在基因轉錄后調控生長發育過程，可通過與靶基因特異性結合參與疾病的發生、發展。本研究中，兩組TSH、FT3、FT4 水平比較差異無統計意義；轉移組miR?194?5p、Tg 及TgAb 水平高于非轉移組，從本研究結果看出，miR?194?5p在分化型甲狀腺癌患者中呈高表達，能參與分化型甲狀腺癌的調控與轉歸。吳彩娓等［17］研究證實，microRNA 能參與機體細胞的增殖、凋亡、免疫應答、生長發育、腫瘤的發生過程，microRNA 介導的轉錄后基因沉默與腫瘤形成的關系為當前研究的熱點。miR?194 小家族包括miR?194a 和miR?194b 兩個成員，二者在3′端存在兩個核苷酸區別。miR?194能作用于RIG?I 通路及TLRs/MyD88/NF?kB 等信號通路，并對通路中的細胞炎性因子進行調節，從而負向調節固有免疫的強度［18］。本研究ROC 曲線結果表明miR?194?5p聯合甲狀腺功能指標能提高分化型甲狀腺癌患者術后轉移預測效能。郭琪等［19］研究表明：miR?194?5p與甲狀腺癌存在緊密的聯系，能參與甲狀腺癌的發生、發展和轉歸，亦可實現甲狀腺良惡性結節的區分和鑒別。而在分化型甲狀腺癌患者中，miR?194?5p能通過調控靶基因的表達及相關信號通路，參與腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移及凋亡等生物學過程。本研究Pearson 相關性分析結果看出分化型甲狀腺癌患者手術后，加強患者miR?194?5p水平測定，了解患者術后甲狀腺水平，或可預測患者術后轉移，對于檢測異常者應盡早采取干預措施，鞏固手術效果，延長患者生存期。

綜上所述，miR?194?5p在分化型甲狀腺癌患者中呈高表達，對患者術后轉移可能具有較高的預測靈敏度及特異度，且與Tg 及TgAb 水平存在正相關。