數字PCR法檢測血液EGFR基因T790M突變的評價

曲守方 徐任 張文新 黃傳峰★ 黃杰★

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因，其中非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）占85%［1］。NSCLC 患者中存在多種腫瘤基因突變類型，表皮生長因子受體（epidermal growth factor re?ceptor，EGFR）基因是目前NSCLC 治療最重要的分子靶點。針對NSCLC 的靶向治療進展迅速，已獲批準的表皮生長因子受體（epidermal growth fac?tor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine ki?nase inhibitors，TKIs）藥物，包括吉非替尼（Gefi?tinib）、阿法替尼（Afatinib）和甲磺酸奧希替尼（Osimertinib）等［2?3］。NSCLC 患者通常在接受一或二代TKI 靶向治療后9～14 個月時會發生獲得性耐藥，EGFR基因第20 號外顯子發生的T790M 突變是最常見的獲得性耐藥［4?5］。美國國立綜合癌癥網 絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）發布的非小細胞肺癌（NSCLC）的臨床實踐指南指出，患者需進行EGFR基因突變檢測。

國內有多家公司開展不同方法的血漿EGFR基因T790M 突變檢測試劑盒的研發。中國食品藥品檢定研究院研制了血漿循環腫瘤DNA 基因突變檢測國家參考品，包括EGFR基因點突變、缺失突變和擴增突變等類型［6］。本研究使用國家參考品，對EGFR基因T790M 突變檢測試劑盒（數字PCR 法）的準確性、特異性和檢測限進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血漿

ctDNAKRAS/ NRAS/ EGFR/ BRAF/MET基因突變檢測國家參考品，由中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）提供。

1.1.2 試劑

人EGFR基因T790M 突變檢測試劑盒（數字PCR 法）和核酸提取及純化試劑，上海源奇生物醫藥科技有限公司提供；微滴生成油，購自美國伯樂公司。

1.1.3 儀器

NanoDrop 紫外可見分光光度計，型號：2000c，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；微滴式數字PCR 系統，型號：QX200，美國BIO RAD 公司；全自動樣本處理系統，型號：JT?DGR?001，生物芯片閱讀儀，型號：JT?Scan?001，長春技特生物技術有限公司。

1.2 方法

按照試劑盒說明書進行操作，使用核酸提取及純化試劑提取EGFR基因T790M 突變的國家參考品（T790M 突變頻率分別為3%，1%，0.3%，0.1%和0.05%）的血漿游離DNA，使用NanoDrop分光光度計進行樣本濃度測定。然后根據試劑盒的檢測限要求將0.05%突變頻率的EGFR基因T790M 突變的檢測限樣本稀釋至2 ng/μL。取不同突變頻率EGFR基因T790M 突變的游離DNA樣本6 μL，加 入14 μL PCR 預混液（ddPCR 和ddPCR MIX3）中。混勻后使用全自動樣本處理系統進行微滴制備。將微滴轉入96 孔板內后，使用微滴式數字PCR 系統的封膜儀和PCR 儀進行封膜和PCR 擴增，程序：95℃10 min；（94℃15 sec，58℃60 sec），40 個循環；98℃10 min；4℃5 min。取PCR 擴增樣本，加至試劑盒的芯片中，使用生物芯片閱讀儀讀取結果。采用QuantaSofrt 軟件分析，3 個及以上微滴出現在FAM 信號的陽性區域（ch1+ch2?）時，結果判為EGFR基因T790M 位點突變。計算陽性和陰性微滴的數量及陽性微滴的比例，根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算出待檢靶分子的濃度或拷貝數。

2 結果

對于不同突變頻率（3%、1%、0.3%和0.1%）EGFR基因T790M 突變的國家參考品樣本，樣本結果顯示Ch1+Ch2?區的點數均≥3 個，試劑盒能夠準確檢出T790M 突變陽性。見表1、圖1。對于2 ng/μL 濃度的0.05%突變頻率的EGFR基因T790M突變的國家參考品樣本，樣本結果顯示Ch1+Ch2?區的點數為3 個，試劑盒能夠準確檢出T790M 突變陽性。見表1、圖2。

圖1 試劑盒的檢測限的結果［CP_018_05（0.05%）］Figure 1 The limit result of kit［CP_018_05（0.05%）］

圖2 試劑盒的準確性結果［（CP_018（3%，1%，0.3%，0.1%）］Figure 2 The accuracy result of kit［CP_018（3%，1%，0.3%，0.1%）］

表1 試劑盒的準確性結果Table 1 The accuracy result of kit

對試劑盒范圍外的EGFR基因其他突變樣本，如G719S 突變的樣本CP_019_01（3%），Ch1+Ch2?區的點數為0 個，試劑盒未檢出T790M 突變陽性。見圖3。

圖3 試劑盒的特異性結果（CP_019_01（3%））Figure 3 The specific result of kit（CP_019_01（3%））

3 討論

EGFR基因位于人類7 號染色體的短臂上，其突變主要發生在胞內酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）區域的前四個外顯子上（18～21）。EGFR作為癌癥治療的分子靶標受到普遍關注。研究顯示腫瘤患者的外周血中存在來源于凋亡或者壞死的腫瘤細胞的循環腫瘤DNA（cell tumor DNA，ctDNA），患者血液中可以檢測到與腫瘤組織高度一致的腫瘤基因突變。對晚期肺癌患者，在不能獲取肺癌組織樣本時，可以選擇外周血樣本進行相關腫瘤基因突變檢測。《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》的發布［7］，規范了中國EGFR基因血液檢測。血漿EGFR基因突變檢測方法包括擴增阻礙突變阻滯擴增系統（amplification refractory mutation sys?tem，ARMS）法、二代測序法（next generation se?quencing，NGS）和微滴數字聚合酶鏈反應法（droplet digital polymerase chainaction，ddPCR）等［8?10］。目前國家藥品監督管理局僅批準了廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司的人類EGFR基因突變檢測試劑盒（熒光PCR 法），用于血漿樣本EGFR基因突變的檢測。研究報道第三代EGFR?TKI 的奧希替尼對出現EGFR基因T790M突變的耐藥患者有較好的治療效果［11］，EGFR基因T790M 突變的檢測具有重要的臨床指導作用。《中國非小細胞肺癌患者EGFRT790M 基因突變檢測專家共識》的發布，對T790M 突變檢測進行相應的規范［12］。

為了評價不同方法的腫瘤基因突變檢測試劑盒性能，EGFR基因T790M 突變的國家參考品樣本設置了不同的突變頻率梯度，并使用二代測序法進行驗證。國家參考品也提供了陰性血漿樣本，可以根據試劑盒的檢測限要求用于樣本的稀釋。本研究結果顯示試劑盒對3%～0.1%突變頻率的EGFR基因T790M 突變的國家參考品，能夠準確檢出標示的T790M 突變；對國家參考品中EGFR基因其他突變的樣本，如EGFR基因G719S突變，未檢出試劑盒范圍內的T790M 突變，表明試劑盒具有很好的準確性和特異性。人EGFR基因T790M 突變檢測試劑盒（數字PCR 法）可以檢測0.05%突變頻率的EGFR基因T790M 突變；使用陰性血漿樣本對0.1%國家參考品稀釋后的樣本進行檢測限性能評價，試劑盒能夠準確檢出T790M 突變，表明檢測限符合要求。研究結果表明國家參考品可以用于評價數字PCR 法的血漿EGFR基因T790M 突變檢測試劑盒的準確性、特異性和檢測限，拓寬了其檢測方法的適用性。