云南地區非小細胞肺癌10種驅動基因突變聯合檢測分析

蘇國苗 王娟 李振輝 潘國慶 李彥熙 劉士岳 曾定濤 楊哲 雷梓★

肺癌目前已經成為全球發病率和死亡率增長最快的腫瘤之一，對人群健康和生命構成嚴重的威脅。2020年全球新增1 930 萬例癌癥病例中，肺癌發病率位居第二，僅次于乳腺癌，然而死亡率位居第一，在中國，特別是非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）位居惡性腫瘤之首［1］。云南地區的肺癌發病率和死亡率，特別是宣威地區在中國乃至全世界都位居前列，其相關驅動基因研究和個體化治療越來越受到重視。全面了解NSCLC 基因突變譜，能夠幫助臨床選擇合適的靶向藥物進行治療，從而有效延長患者生存期。常見驅動基因（如EGFR、ALK、ROS1等）的靶向治療藥物阿法替尼、奧希替尼等上市，肺癌患者治療療效得到顯著改善［2］。因此，本次研究探討NSCLC多驅動基因聯合檢測對臨床診療的意義，為臨床個體化治療提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016年7月至2021年7月昆明醫科大學第一附屬醫院經病理診斷為NSCLC 的云南地區樣本227 例，其中福爾馬林固定石蠟包埋組織204例，細胞涂片23 例；男性101 例，女性126 例；年齡范圍22～89 歲，中位年齡55 歲；腺癌213 例、鱗癌12 例、腺鱗癌1 例、大細胞癌1 例；原發灶184 例，轉移灶43 例。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 腫瘤樣本采集及DNA、RNA 提取

病理醫師鏡下篩片，調取蠟塊進行切片裝管（厚度：6～10 μm，數量8～12片）。使用廈門艾德生物醫藥有限公司的石蠟組織DNA 和RNA 提取試劑盒，按照說明書提取石蠟組織腫瘤樣本的DNA 和RNA。

1.3 NSCLC 驅動基因檢測

采用美國ABI公司QPCR儀（型號：7500），依據突變擴增阻滯系統（ARMS 法）的原理檢測NSCLC 10種基因。檢測試劑盒（基因突變檢測試劑盒?熒光PCR 法）采用廈門艾德生物醫藥有限公司，每次實驗均設定陰、陽對照及內參照，并根據試劑盒說明書判讀結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析；計數資料以n（%）進行描述，采用χ2檢驗；理論頻數<5 的則采用Fisher 確切概率法檢驗；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 10 種驅動基因突變聯合檢測情況

227 例NSCLC 標本中，10 種驅動基因的總突變率為78.85%（179 / 227）。EGFR突變頻率最高，KRAS突變位居第二，ALK融合位居第三。見圖1。

圖1 227 例NSCLC 患者10 種基因突變頻率分布Figure 1 Frequency distribution of 10 gene mutations in 227 patients with NSCLC

通過對不同樣本10 基因突變檢測比較顯示：原發灶的突變檢出率與轉移灶比較，術后石蠟樣本突變檢出率與細胞學樣本比較，差異無統計學意義（P均>0.05）。見表1。

表1 不同樣本10 基因突變檢測率比較［n（%）］Table 1 Ratio of detection rate of 10 gene mutations in different samples［n（%）］

2.2 EGFR 基因突變特點

在227 例NSCLC 患者中，共檢出EGFR基因突變102 例（44.93%）。主要以19Del 和21 號外顯子L858R為主型，占總突變率的78.43%。見表2。

表2 EGFR 基因突變與臨床病理特征的關系Table 2 Relationship between EGFR gene mutation and clinicopathological features

2.3 10 種基因突變與臨床特征關系分析

10 種基因突變數據分析顯示：EGFR基因突變率在女性患者高于男性患者，腺癌患者高于非腺癌患者，不吸煙患者高于吸煙患者，差異有統計學意義（P<0.05）。HER2基因突變率在女性患者高于男性患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 NSCLC 患者EGFR 基因突變類型及檢出率Table 3 Type and proportion of EGFR gene mutation in NSCLC patients

3 討論

在NSCLC 靶向治療前，全面了解腫瘤基因突變狀態才能實施有效的個體化治療。NSCLC 患者10 基因聯合檢測已是臨床NSCLC 個體化治療的重要參考依據［3］。EGFR屬于酪氨酸激酶I 型受體，是上皮生長因子（epithelial growth factor，EGF）細胞增殖和信號傳導的受體，其功能缺失或其相關信號通路中關鍵因子的活性或細胞定位異常，與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡有著密切的關系［4?5］。ALK基因屬于胰島素受體家族，通過基因重排進而激活下游信號通路導致癌變發生，可與多種基因發生融合，主要以EML4?ALK融合突變最為常見［6］。ROS1基因定位于6q21 染色體，在NSCLC 中主要與CD74、SLC34A發生融合，激活ROS1酪氨酸激酶區及下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK 等信 號通路，進而引起腫瘤的發生［7］。KRAS基因在NSCLC患者中以G12C 和G12V 突變最為常見［8］。BRAF基因在EGFR信號通路中位于KRAS下游，其突變引起編碼氨基酸的改變，導致編碼蛋白持續被激活，細胞惡性增殖引起癌變，以15 號外顯子V600E突變位點為主。NRAS基因常見Exon?3 外顯子Q61R/K/L/H 突變；PIK3CA基因常見Exon?9 和20號外顯子E545K 和E545Q 突變；HER2基因常見20號外顯子的插入突變；RET基因常見12 號外顯子融合突變；MET基因突變常見14 號外顯子缺失突變，在NSCLC 患者中多作為EGFR基因突變患者接受TKI 治療后產生的耐藥突變而繼發性存在［9?10］。

既往相關研究數據顯示，在中國人群中，NSCLC 患者EGFR突變陽性率最高（39.0%），其次是KRAS（8.0%）和ALK（5.5%），ROS1（2.1%）和BRAF（0.6%）突變陽性率相對較低［11］。本研究與前期研究數據基本吻合，造成檢測結果組間差異的原因可能是研究的人群差異和采用的檢測方法靈敏度不同，以及檢測樣本來源的不同。同時，通過對云南地區不同樣本10 基因突變檢測比較顯示石蠟組織或細胞樣本、原發灶或轉移灶，都能夠用于腫瘤驅動基因突變檢測，與相關研究報道一致［12］。

國內外針對EGFR基因突變的最新研究顯示，EGFR是NSCLC 最常見的驅動基因突變，在亞洲人群突變頻率約50%［13］，主要存在于外顯子18、19、20、21，最常見的類型為19 號外顯子缺失和21 號外顯子L858R點突變，且多見于肺腺癌為主，亞裔、女性、非吸煙者，且瘤體積更小、分期更早的人群，更易從靶向治療中獲益［14］。本次研究EGFR基因突變的檢出率為44.93%，以19 號外顯子缺失和21 號外顯子L858R 點突變為主；女性患者突變率高于男性患者；腺癌患者的突變率高于非腺癌患者；不吸煙患者中的突變率高于吸煙患者；與患者年齡、TNM 分期無關。

在中國EGFR基因的突變存在顯著的地域差異，相關文獻報道，廣西與華南地區的EGFR基因主要以19 號外顯子缺失突變為主［15?16］，四川與云南地區以21 號外顯子L858R位點突變為主［17?18］。本研究結果顯示，云南地區NSCLC 患者中，EGFR基因主要以21 號外顯子L858R位點突變為主，19 Del次之，與相關報道一致。

因此，NSCLC 患者10 種基因突變聯合檢測可一次獲得更多基因突變信息，為分子靶向用藥提供更加全面的指導信息，對于臨床取材量少標本意義重大，并且10 種基因聯合檢測有利于發現相應靶向治療的敏感基因及耐藥基因，從而更精確的篩查靶向治療的適應人群和判斷靶向治療的療效，更全面地指導臨床治療。

綜上所述，云南地區NSCLC 患者10 種基因突變以EGFR基因突變率最高，與樣本是否轉移、樣本類型均無關；EGFR突變以19Del 和21 號外顯子L858R 為主型，多見于女性、無吸煙史及腺癌患者，與年齡及TNM 分期無關。HER2基因突變多見于女性患者，與患者年齡、是否吸煙、組織學類型以及TNM 分期無關。ALK、ROS1、KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA、RET及MET基因與NSCLC 患者性別、年齡、是否吸煙、組織學類型、TNM 分期均無關。