氣相色譜內標法測定注射級聚山梨酯80 中乙二醇、二甘醇、三甘醇殘留量

謝華萍，鄧雙炳,2，魏勇翔，鐘仁清，唐會英，張繼輝

1.江西青峰藥業有限公司，江西 贛州 341000；2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；3.江西省藥品檢查員中心第三檢查所，江西 贛州 341000

現今，隨著中藥注射劑不斷地發展，在臨床上廣泛應用，關于其不良反應的研究也逐漸增多［1-3］，輔料的質量安全也逐漸成為大家關注的重點，有研究表明［4］，輔料在藥品制劑的質量、安全性和有效性方面有重要的影響，也越來越多證據表明，注射劑中輔料造成的不良反應的是很多注射劑不良反應的根源甚至可以引起群體性藥害事件［5］，如依托泊苷注射液、多西紫杉醇注射液和魚腥草注射液等事件［6-7］，均表明聚山梨酯80 是引起不良反應的主要原因之一。因此聚山梨酯80 的質量安全性研究應該進一步加強，殘留溶劑是評價質量安全性的重要指標，現今注射劑藥用輔料殘留溶劑研究的文獻［8］非常少。乙二醇、二甘醇及二甘醇，是聚山梨酯80 合成過程中使用了環氧乙烷而形成的副產物，在終產品中很有可能存在，可能具有一定的毒性［9］，存在較大風險。《中國藥典》2020 年版［10］方法對三種溶劑進行了研究，但是該方法柱溫升溫程序較長，故對方法進行探索。本研究參考《中國藥典》2020 年版四部通則［10］，建立氣相色譜（GC）法同時測定注射用輔料聚山梨酯80 中的乙二醇、二甘醇、三甘醇。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

7890B 氣相色譜儀（安捷倫公司）、XS205 電子天平（梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 試藥

乙二醇（批號：140812-001，廣東光華科技股份有限公司），二甘醇（批號：151208-001），三甘醇（批號：151208-001）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,3-丁二醇（批號：150602-001，上海麥克林生化科技有限公司），無水乙醇（批號：200409-005，美國天地公司）；聚山梨酯80（批號：180301、180302、190502，湖北葛店人福藥用輔料有限責任公司）。

1.3 溶液的制備

空白溶液：無水乙醇。內標溶液：取適量1,3-丁二醇，精密稱定，用無水乙醇制成每1 mL 含1,3-丁二醇4 mg 的溶液。供試品溶液：精密稱定樣品聚山梨酯80 約4 g，加入100 mL 量瓶中，再精密移取內標溶液1 mL，加無水乙醇至刻度，混勻。對照品貯備溶液：分別取適量二甘醇、三甘醇和乙二醇，精密稱定，用無水乙醇稀釋制成每1 mL 含二甘醇、三甘醇和乙二醇各4 mg 的溶液。對照品溶液：精密量取對照品貯備溶液及內標溶液各1 mL，置于100 mL 量瓶中，加無水乙醇至刻度，混勻。靈敏度試驗溶液：取對照品溶液1 mL，精密量取，置于10 mL 量瓶中，加無水乙醇至刻度，混勻。

1.4 色譜參數

色譜柱：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷（DB-624，60 m×0.32 mm×1.8 μm）為固定液的毛細管柱。柱溫：程序升溫，具體參數見表1；載氣（N2）流速5 mL/min，分流比為2∶1，進樣口溫度為230 ℃，檢測器溫度為250 ℃。

表1 升溫程序

1.5 測定法

分別取空白溶液、靈敏度溶液、內標溶液、對照品溶液及供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。

2 方法與結果

2.1 專屬性

分別取空白溶液、對照品溶液及供試品溶液按照擬定方法進行測定，結果乙二醇、1,3-丁二醇、二甘醇、三甘醇保留時間分別為6.382 min、11.057 min、12.871 min、18.111 min，各組分的分離度大于2.0，且空白對測定無干擾，專屬性良好。見圖1。

圖1 色譜圖：A.空白溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液

2.2 檢測限與定量限

照“1.3”項下制備對照品溶液，再用空白溶液稀釋成不同濃度，以3 倍基線噪音計算，可以得到乙二醇、二甘醇、三甘醇的檢測限；以10 倍基線噪音計算，可以得到乙二醇、二甘醇、三甘醇的定量限，結果表明，此方法的檢測靈敏度及定量限均能達到報告限度的要求。見表2。

表2 3種溶劑的檢測限及定量限、線性關系

2.3 線性與范圍

取“1.3”項下對照品貯備液，用無水乙醇制成每1 mL 溶液中含乙二醇和二甘醇、三甘醇定量限濃度及8 μg、20 μg、40 μg、48 μg、60 μg 濃度的線性溶液，進樣測定。

繪制的標準曲線縱坐標為各溶劑的峰面積，橫坐標為不同濃度。結果表明，各溶劑相關系數（r）均大于0.999 0，能滿足線性要求。見表2。

2.4 精密度

按“1.3”項下制備空白溶液及對照品溶液。加標供試品溶液：精密稱定聚山梨酯80 樣品6 份，約4 g，置于100 mL 量瓶中，再精密加入內標溶液及對照品貯備液各1 mL，加無水乙醇至刻度，混勻。按照擬定方法進行測定，計算各溶劑測定值RSD（n=6），均不超過10%，方法的重復性符合驗證要求；由不同人員、不同日期，同重復性試驗的方法進行中間精密度測定，將結果與重復性試驗測定的結果計算各溶劑測定值的RSD（n=12），均不超過10%，方法的中間精密度符合驗證要求。表明方法的精密度良好。見表2。

2.5 準確度

按“1.3”項下制備空白溶液及對照品溶液。加標供試品溶液：精密稱定聚山梨酯80 樣品9 份，約4 g，置于100 mL 量瓶中，精密移取1 mL 內標溶液，再精密移取0.8 mL、1 mL、1.2 mL 對照品貯備液（由于目標成分為未檢出或者含量較低，故統一按照限度濃度進行加標，加標濃度分別為限度濃度的80%、100%、120%），每個濃度水平各三份，再加無水乙醇至刻度，混勻。分別按照擬定方法進行測定，并計算各溶劑的回收率和RSD。各溶劑回收率范圍為80%～120%，且RSD 小于10%，表明準確度良好。分別見表3～5。

表3 乙二醇回收率試驗結果

表4 二甘醇回收率試驗結果

表5 三甘醇回收率試驗結果

2.6 耐用性

2.6.1 溶液穩定性在自然條件下，取“2.4”項下加標供試品溶液，分別于0、4、8、24 h 進樣，計算結果為RSD 為0.2%～8.2%，說明自然條件下的供試品溶液24 h 內穩定。

2.6.2 色譜參數變化取“1.3”項下的對照品溶液和“2.4”項下加標供試品溶液，分別按正常參數和調整流速、柱溫等參數條件下進樣，以各溶劑含量為測定值。計算參數變化后的測定值和正常參數測定值的RSD。結果顯示，流速的變化范圍為4.5 mL～5.5 mL，各溶劑的RSD 不大于3.5%；柱溫的變化范圍為55 ℃～65 ℃，各溶劑的RSD 不大于2.8%。均不大于10%，方法耐用性良好。

2.7 樣品結果

取3 批聚山梨酯80 樣品按擬定方法測試，結果見表6。

表6 樣品測試結果表（%）

3 討論

本研究主要建立了注射級藥用輔料聚山梨酯80中乙二醇、二甘醇、三甘醇殘留溶劑檢測方法并進行方法學驗證，結果表明方法專屬性強、重復性好、準確度高、操作簡便。本研究對中國藥典方法進行優化，縮短了檢測分析時間，節約時間及成本，可為聚山梨酯80 的殘留溶劑控制提供一種替代方案；也為其他注射級藥用輔料的殘留溶劑分析方法提供參考，具有一定的指導意義。