杞菊地黃口服液質(zhì)量控制研究

南榮華，張娜，康小鳳，賈萌,3，黃艷

1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065；2.陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)院，陜西 西咸新區(qū) 712046；3.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065

杞菊地黃口服液由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮等加工而成，滋腎養(yǎng)肝，用于肝腎陰虧，暈耳鳴，明畏光，迎風(fēng)流淚，視物昏花［1］。熟地黃富含地黃素、梓醇等多種微量元素［2］，具有抗氧化，增強(qiáng)免疫力的藥理作用［3-4］。山茱萸有補(bǔ)益肝腎，收澀固脫功效，其化學(xué)成分具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化等作用［5］。牡丹皮具有抗氧化，抗菌，抗炎作用，其多糖對(duì)糖尿病有治療作用［6-10］。標(biāo)準(zhǔn)初收錄于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十一冊(cè)［11］，2020 版《中國(guó)藥典》中列入馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚含量測(cè)定，文獻(xiàn)資料對(duì)其余成分的含量研究報(bào)道較少。此次研究，同步測(cè)定6個(gè)指標(biāo)成分含量，為該制劑質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Sartorius BP211D 電子分析天平（d=0.01,0.1 mg，賽多利斯公司）；LC-2040C 3D 高效液相色譜儀（島津，二極管陣列檢測(cè)器，Empower 色譜工作軟件）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器；UV-2550 紫外分光光度計(jì)；UPH-11-10T 超純水機(jī)（優(yōu)普公司）。

1.2 試藥

沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-201204，純度89.9%）；綠原酸（批號(hào)：110753-201716，純度99.3%）；莫諾苷（批號(hào)：111998-201703，純度97.4%）；馬錢苷（批號(hào)：111640-201707，純度99.2%）；木犀草苷（批號(hào)：111720-201609，純度94.9%）；丹皮酚（批號(hào)：110708-201407，純度99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。杞菊地黃口服液樣品為國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)所得，陰性對(duì)照為自購(gòu)合格藥材按處方工藝制得。乙腈為色譜純（德國(guó)默克），水為超純水；其余試劑為分析純（國(guó)藥化學(xué)試劑公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：（安捷倫C18 柱4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A（乙腈）,B（0.1%甲酸溶液）梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm（沒(méi)食子酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草甘、丹皮酚），328 nm（綠原酸）；進(jìn)樣量：10～25 μL；理論塔板數(shù)以馬錢苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，梯度見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取沒(méi)食子酸、綠原酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚6 種對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度各為0.056 57、0.023 34、0.109 17、0.076 07、0.020 78、0.190 21 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密量取供試品5 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，振搖后超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）15 min，放至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

吸取“2.2”項(xiàng)下四種溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定?？瞻兹芤簾o(wú)干擾，專屬性好，各組分分離完全，見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.混合對(duì)照品（240 nm）；B.混合對(duì)照品（328 nm）；C.供試品（240 nm）；D.供試品（328 nm）；E.空白溶液（240 nm）；F.空白溶液（328 nm）

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取馬錢苷對(duì)照品7.18 mg、莫諾苷對(duì)照品7.75 mg、丹皮酚7.51 mg 置25 mL 量瓶中，再精密加入綠原酸對(duì)照品溶液（濃度0.233 4 mg/mL）、木犀草苷對(duì)照品溶液（濃度0.207 8 mg/mL）、沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液（0.565 7 mg/mL）各5 mL，加入50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，作為線性濃度①。分別精密吸取線性濃度①溶液5.0、3.0、2.0、1.0 mL 置10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性濃度②、③、④、⑤。再取線性濃度⑤溶液，精密吸取5.0 mL 置10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，作為線性濃度⑥。分別精密吸取上述六種溶液各10 μL，按擬定方法進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程分別為：沒(méi)食子酸Y=888 642.35X-1 163.13，r=1.000 0；綠原酸Y=2 968 925.52X-8 028.39，r=1.000 0；莫諾 苷Y=1 649 043.91X-241.06，r=1.000 0；馬 錢苷Y=1 477 886.09X-5 639.72，r=1.000 0；木犀草苷Y=1 855 045.43X-1 177.50，r=1.000 0；丹皮酚Y=1 250 925.49X+46 760.59，r=1.000 0。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸進(jìn)樣量0.056 6～1.131 4 μg、綠原酸進(jìn)樣量0.023 3～0.466 8 μg、莫諾苷進(jìn)樣量0.151 0～3.019 4 μg、馬錢苷進(jìn)樣量0.142 5～2.849 0 μg、木犀草苷進(jìn)樣量0.020 8～0.415 6 μg、丹皮酚進(jìn)樣量0.150 0～3.001 0 μg，線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，按擬定色譜條件測(cè)定峰面積。沒(méi)食子酸、綠原酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚峰面積的RSD 值依次為0.17%、0.11%、0.13%、0.11%、0.17%、0.06%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10 μL，按擬定色譜條件進(jìn)樣6 次，每次間隔5.5 h，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批號(hào)口服液，照擬定方法平行制備供試品溶液6 份，測(cè)定峰面積，計(jì)算得沒(méi)食子酸、綠原酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草苷和丹皮酚含量的RSD 值分別為0.30%、0.72%、0.42%、0.24%、1.31%、0.65%。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密吸取已知含量的杞菊地黃口服液（沒(méi)食子酸0.156 6 mg/mL，綠原酸0.010 85 mg/mL，莫諾苷0.364 8 mg/mL，馬錢苷0.176 6 mg/mL，木犀草苷0.013 33 mg/mL，丹皮酚0.085 16 mg/mL）6 份，每份2.5 mL，精密加水2.5 mL，精密加入對(duì)照品混合溶液（沒(méi)食子酸0.023 752 mg/mL，綠原酸0.002 343 mg/mL，莫諾苷0.058 869 mg/mL，馬錢苷0.025 038 mg/mL，木犀草苷0.002 05 mg/mL，丹皮酚0.012 268 mg/mL）20 mL，同法制備供試品溶液，按擬定色譜條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2（n=6）。

表2 加樣回收收率結(jié)果

2.9 耐用性試驗(yàn)

更換安捷倫1260 Ⅱ型高效液相色譜儀，資生堂SPOLAR C18 色譜柱，樣品待測(cè)定峰均分離完全，說(shuō)明耐用性良好。

2.10 樣品含量測(cè)定

以擬定方法測(cè)定從全國(guó)23 個(gè)省、自治區(qū)、直轄市的不同的抽樣地點(diǎn)抽取的7 家不同生產(chǎn)企業(yè)樣品65 批。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定表（mg/mL）

3 討論

3.1 提取條件

試驗(yàn)建立過(guò)程中，參考各方文獻(xiàn)，在考察供試品的制備方法時(shí)，考慮到六種成分的溶解特性，考察水、50%甲醇、甲醇為溶劑，結(jié)果顯示，以50%甲醇為溶劑［12］，測(cè)定各成分的含量最高；另外考察提取溶劑體積20 mL、50 mL，結(jié)果顯示20 mL 即可提取完全；考察提取方法及時(shí)間，結(jié)果超聲提取和加熱回流提取率差異不大，選擇超聲提取15 min 便于操作。

3.2 色譜條件

試驗(yàn)考察有機(jī)相（甲醇、乙腈），水相（水、0.1%甲酸溶液），梯度洗脫，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，基線平穩(wěn)，分離度較好［13］；考察柱溫（25、30、35、40 ℃），為40 ℃時(shí)，供試品色譜中目標(biāo)峰與相鄰峰間分離度最佳。

4 結(jié)論

此次建立的方法，可以同步測(cè)定杞菊地黃口服液中沒(méi)食子酸、綠原酸、莫諾苷、馬錢苷、木犀草苷、丹皮酚六種成分含量，專屬性較強(qiáng)，一定程度上同時(shí)控制制劑中酒萸肉、牡丹皮、菊花3 味藥材的質(zhì)量，體現(xiàn)不同生產(chǎn)企業(yè)、不同批次之間的差異和穩(wěn)定性［14-15］,評(píng)價(jià)市售杞菊地黃口服液質(zhì)量。以性質(zhì)穩(wěn)定、特征性強(qiáng)的馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚為指標(biāo)成分，為企業(yè)質(zhì)控和藥品科學(xué)監(jiān)管提供新的技術(shù)參考。