線粒體內膜轉位酶50 在人胃癌組織中的表達及其臨床意義△

張王吉，左云，施曉婧，吳倍佩，倪晨，張永芹

蘇州大學附屬張家港醫院腫瘤科，江蘇 張家港 215600

胃癌是目前世界范圍內第五大常見惡性腫瘤，也是腫瘤相關死亡的第四大原因，2020 年新增胃癌患者100 多萬例，估計有79.6 萬例死亡（相當于全球每13 例死亡病例中就有1 例因胃癌所致）[1]。中國是胃癌的高發國家，2020 年中國胃癌新發病例和死亡病例分別占全球的62.3%和51.4%[1]。由于胃癌早期癥狀不典型及患者對癥狀的忽視，致使中國約80%的初治胃癌患者已處于進展期和晚期[2-3]。胃癌晚期治療以化療、放療、靶向治療和免疫治療等綜合治療為主，但治療效果不盡如人意，5 年生存率僅為35.9%[4]。因此，了解胃癌的發生發展機制，尋找新的診斷和治療靶點成為胃癌治療的重中之重。線粒體內膜轉位酶50（translocase of inner mitochondrial membrane 50，TIM50）是位于線粒體內膜的TIM23 復合體的一個亞基，在線粒體蛋白輸入和分選中發揮重要作用[5]。人TIM50 由353 個氨基酸組成，大小約為40 kD[6]。在基礎條件下，TIM50 作為線粒體蛋白前序列受體，與TIM23亞基相互作用促進前序列蛋白從線粒體外膜轉位酶向TIM23 移交，也觸發了TIM23 前蛋白轉導通道基質側的輸入馬達的組裝和激活，在線粒體蛋白輸入過程中起早期作用[7]。近年來，TIM50 促進多種腫瘤發生發展的作用日益受到關注。研究表明，TIM50作為潛在致癌因子在乳腺癌、非小細胞肺癌、食管癌、腎母細胞癌等惡性腫瘤中呈高表達[8-12]。但TIM50 在人胃癌中的表達國內外文獻尚無報道。因此，本研究對人胃癌組織中TIM50 的表達及其臨床意義進行探討，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016 年6 月至2018 年7 月蘇州大學附屬張家港醫院收治的85 例胃癌患者作為研究對象。納入標準：①接受胃癌切除術且經病理檢查確診為胃癌；②術前未接受過放化療。排除標準：①合并其他腫瘤；②病歷資料不完整。85 例胃癌患者中，男性56 例，女性29 例；年齡：≥60 歲55 例，﹤60歲30 例；腫瘤直徑：≥5 cm 58 例，﹤5 cm 27 例；病理分級：Ⅰ/Ⅱ級25 例，Ⅲ/Ⅳ級60 例；TNM 分期：Ⅰ/Ⅱ期33 例，Ⅲ/Ⅳ期52 例；有淋巴結轉移60 例，無淋巴結轉移25 例；有遠處轉移1 例，無遠處轉移84 例。取85 例胃癌患者的胃癌組織及癌旁組織。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 隨訪

以復診或電話方式對胃癌患者術后生存情況進行隨訪，特殊患者必要時上門回訪。總生存時間為術后至隨訪截止時間或死亡時間的間隔。隨訪時間36 個月，隨訪截止時間為2021 年7 月。

1.3 主要試劑

兔抗TIM50 多克隆抗體（22229-1-AP）購自美國PROTEINTECH 公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔二抗及CY3 標記的山羊抗兔熒光二抗均購自Life 公司。

1.4 免疫組化檢測

取新鮮胃癌組織及癌旁組織標本，4%甲醛固定，脫水處理后用石蠟包埋，4 μm 厚度連續切片。切片常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，室溫下3%H2O2孵育10 min。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌3 min×3 次，抗原修復后加山羊血清室溫封閉1 h；加兔抗TIM50 多克隆一抗（1∶1000），4 ℃過夜；PBS 洗滌3 min×3 次，加入HRP 標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min；PBS洗滌5 min×3 次，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色5 min；蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡，中性樹脂封片。待其干燥后，用光學顯微鏡（×200）觀察染色情況。

1.5 免疫組化評估

陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0分，1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。染色強度評分：無染色為0 分，弱染色為1 分（+），中等強度染色為2 分（++），強染色為3 分（+++）。總評分=陽性細胞百分比評分×染色強度評分。根據總評分將患者分為兩組，總評分0～4 分為TIM50 低表達組，總評分5～12 分為TIM50 高表達組。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗。以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TIM50 表達情況的比較

免疫組化結果顯示，胃癌組織中TIM50 主要定位于細胞質中（圖1）。85 例胃癌組織中58 例（68.2%）患者TIM50 高表達，27 例（31.8%）患者TIM50 低表達；85 例癌旁組織中11 例（12.9%）患者TIM50 高表達，74 例（87.1%）患者TIM50 低表達；胃癌組織中TIM50 高表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（χ2=53.886，P﹤0.01）。

圖1 胃癌組織及癌旁組織中TIM50的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 不同臨床特征胃癌患者的胃癌組織中TIM50表達情況的比較

不同病理分級胃癌患者的胃癌組織中TIM50表達情況比較，差異有統計學意義（P﹤0.05）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、TNM 分期、T 分期、N 分期、M 分期胃癌患者的胃癌組織中TIM50 表達情況比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者的胃癌組織中TIM50 表達情況的比較

2.3 生存情況的比較

采用Kaplan-Meier 法繪制胃癌患者生存曲線，結果表明，TIM50 高表達與TIM50 低表達胃癌患者的3 年生存率比較，差異無統計學意義（χ2=1.862，P=0.172）。（圖2）

圖2 TIM50高表達（n=58）與低表達（n=27）胃癌患者的生存曲線

3 討論

胃癌是中國常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率均居第二位，嚴重危害居民的生命健康[13]。目前國內外研究明確胃癌的病因包括幽門螺桿菌感染、不良飲食習慣、非甾體抗炎藥等，但胃癌發生發展分子生物學機制尚未明確[14]。

越來越多證據表明，TIM50 除參與線粒體蛋白輸入外，還參與其他功能。研究發現，人TIM50 在腎上腺和睪丸類固醇合成中發揮重要作用[15]。此外，TIM50 也參與了白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）誘導的白細胞介素-1 受體相關激酶2（interleukin-1 receptor-associated kinase 2，IRAK2）線粒體易位抑制脂肪細胞氧化代謝途徑[16]。有趣的是，TIM50 可以通過降低氧化應激來減輕病理性心肌肥厚[17]，有望成為防治心肌肥厚和心力衰竭的新靶點。多篇報道表明，TIM50 基因突變與先天代謝缺陷疾病3-甲基戊烯二酸尿癥相關，此外研究者對患者線粒體功能綜合分析后發現，TIM50 突變通過靶向線粒體的幾個關鍵方面，包括維持線粒體形態、Oxphos 組裝和線粒體呼吸能力，導致線粒體功能的普遍缺陷[18-21]。

近年來研究發現，TIM50 水平與各種腫瘤細胞的生長和增殖直接相關[10]。據報道，TIM50 的表達可能通過p53 突變體的過度表達而上調，從而導致乳腺癌和非小細胞肺癌的生長和化學耐藥[9]。研究表明，TIM50 可能抑制乳腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡[11]。在非小細胞肺癌中，TIM50 水平與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結轉移和總生存率直接相關。同一項研究還發現，TIM50 通過細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路促進腫瘤進展并預測非小細胞肺癌患者的不良預后[10]。據報道，肉瘤中發揮抗腫瘤作用的miRNA-7 可調節TIM50 的表達[22]。食管癌中，LOC100133669 表達上調與預后不良相關，在研究潛在致癌機制時發現，其與TIM50 相互結合通過抑制泛素化上調其蛋白水平。此外，LOC100133669 基因被敲低時，過表達TIM50 可挽救食管癌細胞的生長[12]。研究發現，TIM50可能是腎母細胞瘤中原癌基因MYCN的靶基因，表達水平隨著MYCN的耗竭而下調[8]。為了分析TIM50在胃癌中扮演的角色，本研究檢測并分析了TIM50 在胃癌及癌旁組織中的表達情況及與患者臨床特征的關系。

本研究結果顯示，85 例患者胃癌組織中TIM50 高表達率明顯高于癌旁組織，說明TIM50 與胃癌的發生發展關系密切。研究還進一步發現，胃癌組織中TIM50 蛋白表達與病理分級有關，病理分級Ⅲ～Ⅳ級胃癌患者的胃癌組織中TIM50 陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ級患者（P﹤0.05）；TIM50 表達與年齡、性別、腫瘤直徑、T 分期、N 分期、M 分期、TNM 分期無關。該結論提示TIM50 表達與胃癌惡性程度有關。本研究還表明，TIM50 高表達患者的3 年生存率較TIM50 低表達患者低，但差異無統計學意義，考慮與隨訪時間太短有關，將繼續隨訪，探求5 年生存率差異是否有統計學意義。

綜上所述，TIM50 在胃癌組織中呈高表達，與胃癌的發生發展有關，TIM50 有可能成為新的臨床胃癌早期診治靶點，并對評價胃癌惡性程度、早期診斷具有重要意義。