維生素D受體基因多態性與兒童難治性腎病的相關性研究

譚 璐，史瑞明，吳紅艷，黃燕萍

(西安交通大學第一附屬醫院兒科，陜西 西安 710061)

腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是兒童期較為常見的慢性免疫性疾病，近年來發病率逐年增加，約占同期住院泌尿系統疾病患兒的20%。糖皮質激素一直是治療原發性腎病綜合征公認的首選藥物。據不完全統計，有近半數的患兒出現激素依賴或耐藥，轉為難治性腎病，成為臨床極為棘手的問題。新型免疫制劑如麥考酚酯、他克莫司、利妥昔單抗等對難治性腎病有一定的治療效果，但仍有部分患兒病情持續進展，最終進入終末期腎病階段。目前已有證據表明維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)激動劑具有獨立于鈣磷代謝外的腎臟保護作用，可改善慢性腎臟疾病的緩解率[1]。由于VDR基因單核苷酸多態性的存在，不同位點發生基因突變，將導致VDR蛋白結構和功能發生改變，影響其生物學效應。目前針對兒童難治性腎病與VDR基因相關性研究的報道較少，本研究擬通過3個經典VDR受體基因位點Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)，探討VDR基因多態性與兒童難治性腎病的關系，為今后藥物治療靶點提供新思路。

1資料與方法

1.1研究對象

本研究對象分為病例組和正常對照組。病例組：選取2019年1月至2019年12月于我院兒科住院的難治性腎病患兒45例，均為漢族，男童34例，女童11例，年齡為5～13歲。納入標準：符合《諸福堂兒科學(第八版)》腎病綜合征診斷標準，且對激素依賴或耐藥者。排除標準：狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、乙型肝炎相關腎炎、鏈球菌感染后腎炎等具有腎病綜合征表現的繼發性及原發性腎炎；存在骨代謝基礎疾病者；遺傳代謝性疾病；合并其他自身免疫性疾病；腫瘤性疾病；長期服用其他影響骨代謝的藥物(糖皮質激素除外)；依從性差，不能定期隨訪者。所有入組病例隨訪2年。正常對照組：選擇我院兒保科門診健康體檢的兒童95例，既往無泌尿系統疾病及內分泌疾病史，均為漢族，男童51例，女童44例，年齡5～10歲。本研究獲我院倫理委員會審批通過(XJTU1AF2018LSK-203)，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 VDR基因多態性檢測

采集所有研究對象口腔黏膜脫落上皮細胞，經過洗滌、純化后獲得基因組DNA，檢索NCBI 獲取維生素D 受體基因編號為Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)位點，行DNA酶切，加入特異性引物，采用TaqMan熒光探針技術檢測以上3個位點單核苷酸多態性，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)引物及探針由安徽中科生物科技有限公司設計并合成。引物序列、擴增片段長度及探針見表1。PCR 反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環，72℃ 延伸5min。PCR產物37℃酶切過夜，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統觀察擴增條帶并記錄基因型條帶，由第三方醫學檢驗實驗室進行純化測序驗證。

表1 VDR引物名稱及序列

1.3其他指標測定

所有研究對象入組后即采集空腹血，測定血肌酐、尿素、血清活性維生素D3水平；病例組定期監測尿蛋白、血肌酐、尿素值。上述指標測定由我院檢驗科完成。

1.4統計學方法

應用SPSS 18.0軟件進行統計分析，非正態分布的計量資料采用中位數和四分位數間距[M(Q1,Q3)]描述，兩組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗；計數資料采用例數(n)和百分比(%)描述，組間比較用χ2檢驗。計算樣本基因型頻率，確認其符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用Logistic回歸分析法，以患兒是否發生腎病綜合征為因變量，以年齡、性別、維生素D3水平、肌酐、尿素及VDR基因各位點等位基因為自變量，分析各因素對患兒的影響。采用比值比(oddratio,OR)及其95%可信區間(confidence interval,CI)表示相對風險度。檢驗水準α為0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組兒童一般臨床資料的比較

兩組兒童在性別構成比、年齡分布、活性維生素D3水平間的差異有統計學意義(Z/χ2值分別是6.12、-2.33、-6.48，P<0.05)；而血肌酐值和血尿素水平的差異無統計學意義(Z值分別是-1.06、-0.47，P>0.05)，見表2。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果

對病例組和對照組的VDR 3個位點Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示兩組樣本人群基因頻率符合遺傳平衡法則(病例組：χ2值分別是5.44、3.59、5.53，對照組：χ2值分別是0.54、3.96、1.03，P>0.05)。

表2 兩組兒童一般臨床資料的比較[M(Q1,Q3),n(%)]

2.3兩組兒童各位點基因多態性的比較

病例組和對照組兒童在rs2228570位點的基因型及等位基因頻率、rs7975232位點的基因型及等位基因頻率間的差異有統計學意義(χ2值分別為26.36、26.17、22.17、18.45，P<0.05)；而rs1544410位點基因型及等位基因頻率的差異無統計學意義(χ2值分別為2.76、3.03，P>0.05)，該位點與難治性腎病發病無相關性，見表3。

表3 兩組兒童各位點基因多態性的比較[n(%)]

2.4 VDR基因多態性與難治性腎病的相關性

以難治性腎病為因變量，rs2228570 位點或rs7975232位點分別與年齡、性別、血活性維生素D3水平、血肌酐及血尿素組合作為自變量，其中年齡及性別設為分類變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示rs2228570位點、rs7975232位點、活性維生素D3水平、性別及年齡段與難治性腎病具有相關性(P<0.05)。活性維生素D3(OR=0.79，95%CI：0.71～0.86)、rs2228570位點(OR=0.23，95%CI：0.11～0.50)是難治性腎病的保護性因素;rs7975232位點為難治性腎病發生的危險因素(OR=6.30，95%CI：2.53～15.68)。在rs2228570位點作用下，學齡兒較少發生難治性腎病(OR=0.21，95%CI：0.06～0.78)。在rs7975232位點作用下，男童較易發生難治性腎病(OR=7.09，95%CI：2.17～23.21)，見表4和表5。

表4 rs2228570位點與難治性腎病相關危險因素的Logistic回歸分析結果

表5 rs7975232位點與難治性腎病相關危險因素的Logistic回歸分析結果

2.5 VDR基因多態性與難治性腎病預后的關系

將rs2228570位點進一步分為野生型基因(CC)和突變型基因(CT+TT)，rs7975232位點分為野生型基因(CC)和突變型基因(CA+AA)。經糖皮質激素聯合免疫抑制劑治療，難治性腎病預后依隨訪情況分為尿蛋白持續轉陰組和尿蛋白陽性組。經χ2檢驗，rs2228570位點野生型和突變型基因對尿蛋白轉陰的影響有統計學差異(χ2=8.14，P<0.05)，當該位點為野生型基因時患兒尿蛋白更易轉陰；而rs7975232位點不論是野生型還是突變型基因對尿蛋白影響作用相當(χ2=1.23，P>0.05)，見表6。因此，rs2228570位點CC基因型與難治性腎病預后關系密切。

表6 VDR基因多態性與難治性腎病預后的關系

3討論

近年研究發現，某些信號途徑在難治性腎病發生中起著非常重要的作用。除傳統的糖皮質激素聯合免疫抑制劑治療外，研究者多年來試圖通過阻斷或激活某種信號轉導通路，對難治性腎病進行“靶向治療”。目前研究證實活性維生素D可通過與VDR結合，激活下游通路，從而發揮保護腎小球濾過膜、抑制免疫與炎癥反應等作用，但VDR基因單核苷酸多態性決定了個體的預后[2-3]。國內外對于兒童難治性腎病與VDR基因多態性相關性的研究報道較少，本文通過對3個經典VDR位點進行深入研究，以期為難治性腎病的“靶向治療”提供依據。

3.1維生素D受體各基因位點與難治性腎病的相關性分析

本研究結果顯示，兒童難治性腎病男童較女童發病率更高(34例vs 11例)，這與文獻報道的男女童發病比例為3.7:1較相符[2]。維生素D受體rs2228570位點存在2個等位基因C和T，3種基因型CC(野生型)，CT(雜合型)及TT(突變型)；rs7975232位點存在2個等位基因C和A，3種基因型CC(野生型)，CA(雜合型)及AA(突變型)。難治性腎病組rs2228570位點CC基因型及C等位基因頻率、rs7975232位點AA基因型及A等位基因頻率均顯著高于健康對照組；rs1544410位點各基因型在病例組與對照組間的差異無統計學意義。這提示我們rs2228570位點、rs7975232位點與難治性腎病的發生密切相關，而rs1544410位點與難治性腎病發生可能無關。多因素Logistic回歸分析提示rs2228570位點對學齡期兒童難治性腎病具有保護效應，在進一步的長期隨訪中發現該位點為野生型基因CC的預后更好，經聯合免疫抑制劑治療，患兒尿蛋白更易轉陰。rs7975232位點成為男性患兒進展為難治性腎病的高危因素。

3.2 VitD-VDR通路在難治性腎病中的作用機制

本研究顯示兒童難治性腎病的發生與VDR基因核苷酸多態性有密切關系，但并非所有位點都具有積極的正向作用，rs2228570位點具有保護效應，而 rs7975232位點則具有負性效應。我們推測這種保護效應可能的機制為VitD與VDR結合后可阻斷足細胞內Wnt/β-catenin通路激活，從而保護足細胞，減輕尿蛋白，延緩慢性腎臟病的病程進展[3-6]。外源性活性維生素D的干預可上調足細胞VDR表達水平，將這種保護效應放大。而 rs7975232位點的突變可能通過影響VDR mRNA的穩定性，進而影響腎素血管緊張素系統的活性，但具體發生機制仍需進一步研究證實[7-8]。有研究者給予腎臟次全切除的雄性大鼠每天口服活性維生素D，16周后發現大鼠腎小球中結蛋白、增殖細胞核抗原表達減少，增大的腎小球體積較前恢復，蛋白尿減輕，證明活性維生素D可減輕炎性和非炎性慢性腎臟病模型的進展，有抗增殖和抑制腎臟生長的作用，其作用的主要靶細胞是足細胞和系膜細胞[9-11]。本研究也發現難治性腎病患兒活性維生素D3水平遠低于正常健康兒童，且Logistic回歸分析提示活性維生素D3是兒童難治性腎病的保護因素。這給予我們新的治療思路，是否可通過增加外源性活性維生素D3的攝入量而改善難治性腎病的預后[12-13]。

本研究僅針對關中地域的漢族兒童開展，樣本量有限，且VDR基因存在多個單核苷酸多態性位點，不同位點可能出現交互作用而影響實驗結果，故存在一定的局限性，還有待今后進一步研究，以期為兒童難治性腎病的精準治療提供理論依據。