高產L-蘇氨酸的缺陷型大腸桿菌發酵條件優化研究

張昱陽，朱紅薇，楊 洋，袁 成，朱長俊

（嘉興學院生物與化學工程學院，浙江嘉興 314000）

蘇氨酸（Threonine）是人體和動物必需的8 種氨基酸之一，有改善機體免疫、促進人體及禽畜生長等功能。被廣泛用于醫藥、食品強化劑和飼料添加劑等方面[1-2]。目前，蘇氨酸主要通過大腸桿菌等微生物發酵制備[3]。通過對高產L-蘇氨酸的大腸桿菌發酵條件優化，可有效提高L-蘇氨酸產量[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉湯培養基、種子培養基、基本培養基、大腸桿菌發酵培養基，具體配方見文獻[5]；經過育選的賴氨酸、甲硫氨酸缺陷型大腸桿菌，本實驗室保存。L-蘇氨酸標準溶液（1.63×10-4mol/L）；四氯對苯醌乙醇溶液（3.0×10-3mol/L）；硼砂溶液（0.1 mol/L）。

1.2 儀器與設備

UV-1100 紫外分光光度計，SBA1243 電子分析天平；Eppendorf 5810R 離心機。

1.3 試驗方法

試驗流程如圖1 所示。

圖1 試驗流程圖

1.3.1 菌種活化及菌懸液制備

實驗室保存菌株活化，擴大培養。無菌生理鹽水制備成菌懸液，稀釋至108～109CFU/mL。

1.3.2 L-蘇氨酸標準曲線的測定

取0.5 g/L 的L- 蘇氨酸標準溶液，配制成4 μg/mL、8 μg/mL、12 μg/mL、16 μg/mL、20 μg/mL、24 μg/mL 和28 μg/mL 的系列標準溶液。取1.0 mL不同濃度的L-蘇氨酸系列標準溶液于10 mL 容量瓶中，加0.5 mL 硼砂溶液（0.1 mol/L）和1.5 mL 四氯苯醌溶液（3.0×10-3mol/L），定容；50 ℃水浴40 min，冷卻至室溫；以相同方法制備試劑空白為參比，在λ=352 nm 處測其吸光度，重復3 次[6]。

1.3.3 發酵液中L-蘇氨酸含量測定

發酵液4 000 r/min 離心20 min，保留上清液并稀釋至500 倍，測定稀釋液中L-蘇氨酸含量。根據L-蘇氨酸標準曲線求不同發酵液中L-蘇氨酸的含量[7]。

1.3.4 發酵培養基優化

參考賴慧彪等[8]的研究結果，原培養基成分葡萄糖、玉米漿及硫酸銨對發酵結果影響相對較大，其他組分相對含量較少且影響較小。……