一測多評法同時測定不同產地佛手中6種化學成分的含量

曹士政，趙登高，馬燕燕，張焜（五邑大學，廣東 江門 529020）

佛手（Citrus medicaL. var.sarcodactylisSwingle）為蕓香科香櫞屬植物佛手的果實，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效，可用于肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等癥狀[1]。佛手在中國長江以南多地有栽種，主要分為川佛手、廣佛手和金佛手，其質量存在差異。《中國藥典》2020年版采用單一的橙皮苷作為佛手的質量評價指標，難以對佛手的整體質量進行全面控制與準確評價。研究表明，除橙皮苷外，可增加6，7-二甲氧基香豆素、香葉木苷、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯和水合氧化前胡素等5 個成分作為佛手的質量評價指標[2-4]。

一測多評（QAMS）法通過建立各個組分與內參物之間的相對校正因子，可實現多組分的一測多評[5]。QAMS 法不僅可以同時檢測多指標成分，還能降低實驗成本和檢測周期[6]。目前佛手中化學成分的含量測定大多采用外標法[7-11]，實驗操作過程煩瑣，所需對照品價格昂貴。因此，本研究基于超高效液相色譜（UPLC）技術，建立了QAMS 法，測定佛手中5，7-二甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素和佛手柑內酯的含量，為提升佛手的質量控制標準提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相系統（美國Waters 公司），KQ-500VDB 型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司），SQP 電子天平（賽多利斯公司）。

1.2 試藥

佛手藥材于2021年購入，共15 批，由五邑大學生物科技與大健康學院馬燕燕教授鑒定為蕓香科植物佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）的干燥果實，詳細信息見表1；6，7-二甲氧基香豆素（批號：PS020517）、橙皮苷（批號：PS011588）、香葉木苷（批號：PS020083）、水合氧化前胡素（批號：PS001249）、5，7-二甲氧基香豆素（批號：PS021023）、佛手柑內酯（批號：PS002115）（對照品，純度≥98%，成都普思生物科技有限公司）；甲醇（色譜級，默克），乙腈（色譜級，賽默飛世爾），水為超純水。

表1 樣品信息Tab 1 Source information of the samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）， 流速0.4 mL·min-1，進樣量2 μL，柱溫40℃，檢測波長為330 nm，流動相：乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～2 min，10%A；2 ～12 min，10% ～15%A；12 ～17 min，15%A；17 ～17.5 min，15% ～17.2%A；17.5 ～33 min，17.2% ～25%A；33 ～53 min，25% ～75%A；53 ～54 min，75%～95%A；54 ～58 min，95%A；58～59 min，95%～10%A，59～62 min，10% A）。混合對照品與待測樣品的色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）及待測樣品（B）色譜圖Fig 1 Chromatogram of mixed reference substance（A）and sample（B）

2.2 對照品溶液的制備

取對照品6，7-二甲氧基香豆素 1.01 mg，橙皮苷1.06 mg，香葉木苷 1.04 mg，水合氧化前胡素1.03 mg，5，7-二甲氧基香豆素 1.09 mg，佛手柑內酯 1.03 mg，分別用甲醇均配成1 mg·mL-1的對照品溶液。吸取各對照品溶液適量用甲醇稀釋，制成100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 μg·mL-1梯度濃度的系列線性溶液，4℃冷藏靜置備用。

2.3 供試品溶液制備

在25 mL 量瓶中加入佛手果粉末2 g，加入25 mL 甲醇后35 ℃超聲（功率500 W，頻率45 kHz）45 min，冷卻后定容。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察 將“2.2”項下制備的對照品梯度系列線性溶液，按照“2.1”項下色譜條件依次進樣，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制各對照品的回歸方程，信噪比S/N＝10 時求定量限，信噪比S/N＝3 時求檢測限，結果表明，各化合物在相應質量濃度范圍內與峰面積線性關系良好，結果見表2。

表2 佛手中6 種成分線性方程、線性范圍、檢測限和定量限Tab 2 Linear equation，linearity，detection limit and quantification limit of 6 components in Citrus medica

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液2 μL，連續測定6 次，計算得各樣品的日間和日內峰面積RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 精密吸取“2.3”項下供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24、48 h 進樣測定。6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯峰面積的RSD分別為0.69%、0.70%、1.9%、0.62%、0.40%、1.0%，表明供試品溶液在48 h 內穩定。

2.4.4 重復性試驗 按照“2.3”項下方法制備佛手供試品溶液6 份，進樣測定，結果6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯峰面積的RSD分別為2.0%、2.7%、2.3%、2.9%、1.3%、2.7%，表明樣品重復性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 稱量佛手樣品6 份，加入含量相同的對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，求得6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯的平均加樣回收率（n＝6）分別為104.22%、105.36%、100.58%、102.18%、114.85%、100.06%，RSD分別為2.2%、2.1%、2.6%、2.2%、2.7%、0.38%，表明該方法回收率良好。

2.5 相對校正因子fs/i 的建立

本試驗采用多點矯正法。根據fs/i＝fs/fi＝As×Ci/（Ai×Cs）計算QAMS 的fs/i，式中fs/i為內標物對待測組分i的校正因子，As為內標物峰面積，Cs為內標物濃度，Ai為待測組分i峰面積，Ci為待測組分i濃度。以5，7-二甲氧基香豆素為內參物，根據公式分別計算6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、佛手柑內酯的fs/i。

2.6 fs/i 耐用性評價

2.6.1 不同高效液相色譜儀和色譜柱對fs/i的影響分別考察了Waters ACQUITY UPLC H-Class、Aglient 1290 UPLC 兩種高效液相色譜儀和Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Shim pack GLSS C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Supelco Titan C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）三種色譜柱對fs/i的影響，結果顯示6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、佛手柑內酯在不同高效液相色譜儀和不同色譜柱上的fs/i的RSD分別為1.0%、2.5%、2.8%、2.6%、1.4%，均小于3%，單因素ANOVA檢驗顯示差異無統計學意義，說明不同高效液相色譜儀和不同色譜柱對各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.2 不同進樣體積對fs/i的影響 分別精密吸取不同體積（0.6、1、1.3、1.6、2 μL）的混合對照品溶液，依次注入高效液相色譜儀中進行檢測，記錄色譜峰峰面積，考察不同進樣體積對fs/i的影響，結果表明，進樣體積的改變對佛手各成分fs/i無明顯影響，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯fs/i的RSD依次為1.2%、1.4%、1.4%、2.0%、0.94%，均小于2.5%，單因素ANOVA 檢驗顯示差異無統計學意義，說明不同進樣體積對各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.3 不同色譜柱柱溫對fs/i的影響 采用Waters ACQUITY UPLC H-Class，Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），分別使用不同柱溫（25、30、35、40、45 ℃）對混合對照品溶液進行檢測，結果表明，柱溫的改變對佛手6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD依次為1.5%、1.7%、2.4%、1.5%、1.0%，均小于2.5%，單因素ANOVA 檢驗顯示差異無統計學意義，說明不同色譜柱柱溫對各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.4 不同流速對fs/i的影響 分別使用不同流速（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL·min-1）對混合對照品溶液進行檢測，記錄色譜峰峰面積，考察不同流速對fs/i的影響。結果表明，流速的改變對佛手各個成分fs/i無明顯影響，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯fs/i的RSD依次為1.8%、2.2%、1.0%、1.9%、1.9%，均小于2.5%，單因素ANOVA 檢驗顯示差異無統計學意義，說明不同流速對各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.5 不同檢測波長對fs/i的影響 分別使用不同波長（328、329、330、331、332 nm）對混合對照品溶液進行檢測，記錄色譜峰峰面積，考察不同檢測波長對fs/i的影響。結果表明，檢測波長的改變對佛手各個成分fs/i無明顯影響，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯fs/i的RSD依次為2.8%、1.7%、2.7%、2.6%、2.7%，均小于3%，單因素ANOVA 檢驗顯示差異無統計學意義，說明不同檢測波長對各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.6 不同操作人員對fs/i的影響 不同操作人員按照“2.2”項下方法制備對照品，在“2.1”項色譜條件下，分別對混合對照品溶液進行檢測，記錄色譜峰峰面積，考察不同操作人員對fs/i的影響。結果表明，操作人員的改變對佛手各個成分fs/i無明顯影響，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯fs/i的RSD依次為2.2%、1.1%、2.6%、0.85%、1.9%，均小于3%，單因素ANOVA 檢驗顯示差異無統計學意義，說明不同操作人員對各成分的fs/i無明顯影響。

2.7 待測成分的色譜峰定位

通過計算在不同色譜儀和不同色譜柱中，佛手各組分的色譜峰與5，7-二甲氧基香豆素色譜峰的相對保留時間（ts/i），對各待測組分進行定位，結果不同儀器與色譜柱測得的ts/i的RSD均小于2.5%，表明可以以ts/i對佛手中各組分的色譜峰進行定位。

2.8 QAMS 與外標法測定結果的比較

取15 批佛手藥材粉末制成樣品溶液，精密吸取2 μL 注入液相色譜儀進行測定。分別采用QAMS 法和外標法計算15 批佛手中6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內酯的含量，每批3 份，結果見表3。將QAMS 法與外標法測得的各組分含量進行比較，發現兩種方法測得的6 種組分含量基本一致，RSD均小于3%。單因素ANOVA 檢驗分析結果表明，QAMS 法與外標法所得結果差異無統計學意義，說明該QAMS 法可以替代外標法用于佛手藥材的含量測定。

表3 QAMS 法與外標法測得15 批佛手中6 種成分的含量(mg·g-1，n ＝3)Tab 3 Contents of 6 components in 15 batches of Citrus medica measured by QAMS method and ESM (mg·g-1，n ＝3)

2.9 指紋圖譜建立及相似度評價

為了解這15 批來源不同的佛手藥材的差異，本研究進行了指紋圖譜的考察。將15 批佛手藥材按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，將15 批樣品指紋圖譜的CDF 數據文件導入中藥指紋圖譜相似度評價系統（2004 版），進行相似度計算，設置樣品S12圖譜為參照圖譜，根據中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統的操作規范2004A，采用中位數法產生對照指紋圖譜，時間窗寬度為0.1，由19 個峰校正，自動匹配，生成對照指紋圖譜（見圖2），其相似度結果見表4。15 批佛手的相似度均大于0.94，這表明不同產地的佛手藥材具有較高的一致性。四川安岳與廣西桂林的相似度較差，可能與藥材的質量有關。

表4 不同產地佛手的相似度Tab 4 Similarity of Citrus medica from different regious

圖2 15批佛手的UPLC 指紋圖譜Fig 2 UPLC fingerprints of 15 batches of Citrus medica

2.10 聚類分析

以不同產地佛手樣品的19 個峰含量為變量，采用SPSS 22.0 統計軟件對15 批佛手藥材進行聚類分析，結果見圖3。采用組間聯接的聚類方法，選取歐式距離平方和作為樣本測度。當歐式距離平方和為15 時，佛手藥材可以分為3 類，Ⅰ類為S1，S11，S12，S14，S3，S9，S13；Ⅱ類為S2，S7；Ⅲ類為S4，S10，S6，S5，S8，S15。上述結果與相似度評價一致，相同產地不同批次樣品間差異較小，浙江金華與廣東的佛手比較相似，四川、云南、廣西、重慶的佛手比較相似。推測影響分類的結果可能與藥材產地的緯度、氣候及土壤等有一定聯系。

圖3 15批佛手指紋圖譜聚類分析Fig 3 Cluster analysis of fingerprints of 15 batches of Citrus medica

3 討論

與HPLC 法相比，UPLC 法具有靈敏度高、線性范圍寬、分析時間短等優點，本試驗的線性范圍達到了0.05 ～100 μg·mL-1，定量限和檢測限分別達到了0.05 和0.025 μg·mL-1，表明本方法具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍。本試驗對樣品進行了190 ～400 nm 全波長掃描，比較各波長下色譜圖，各成分在330 nm 處均有較大吸收。因此本試驗選用330 nm 為檢測波長。

鐘艷梅等[4]研究顯示，香豆素類成分的含量差異是區分佛手藥材的關鍵指標。佛手中的香豆素類成分具有多種生物活性，水合氧化前胡素具有抗炎、抗腫瘤等活性、6，7-二甲氧基香豆素具有止喘及降血壓作用[12]，佛手柑內酯具有催眠抗腫瘤等活性[14]。因此，本試驗在橙皮苷的基礎上，增加水合氧化前胡素等香豆素類化合物作為指標，建立更全面、快速、高效的多組分含量測定方法。

佛手在我國南方多地均有栽培，根據產地的不同，佛手可分為川佛手、廣佛手、金佛手。本研究聚類分析表明，東南地區的廣東佛手和浙江佛手聚為一類，西南地區的四川、云南和廣西佛手聚為一類。說明不同地域的佛手雖有差異，但亦有相同之處。

綜上所述，本試驗采用UPLC 技術建立了以5，7-二甲氧基香豆素為內參物的QAMS 法，用于測定佛手中5，7-二甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素和佛手柑內酯等6 種化學成分的含量，該方法操作簡便，精密度高，穩定性、重復性好，為全面評價不同產地佛手的質量提供了參考根據。